張疏雨，李劍梅，謝存一，柴林山，朱萬芹

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽 122000）

蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）又名北冬蟲夏草，分類學(xué)上屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、核菌綱（Pyreno?myce?tes）、球殼菌目（Sphaeriales）、麥角菌科（Clavicipti?aceae）、蟲草屬（Cordyceps）[1?2]。蛹蟲草廣泛分布于世界各地，在我國(guó)吉林、遼寧、河北、陜西、甘肅、安徽、山東、湖北、湖南、四川、貴州、福建、廣東、廣西、云南等地均有發(fā)現(xiàn)[3]，其主要化學(xué)成分有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、有機(jī)酸、生物堿、甾醇及酚類、無機(jī)元素和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，不僅具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有抗癌、抗氧化、鎮(zhèn)定安眠、抗炎、治療心腦血管疾病等功效，已被國(guó)家科技部批注為新資源食品，極具營(yíng)養(yǎng)保健食品的開發(fā)潛力[4?8]。目前，關(guān)于蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量?jī)?yōu)化、活性成分含量?jī)?yōu)化、菌絲體收率提升等方面的研究已獲得一些成果[9?10]，特別是通過液體發(fā)酵法培養(yǎng)蛹蟲草菌絲體及發(fā)酵液，不僅周期短、條件簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高，而且有利于活性成分含量提升及目的組分的提取，已經(jīng)成為了蛹蟲草的研究熱點(diǎn)[11?12]。

研究表明，蛹蟲草無性型液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物及其發(fā)酵制品的水和乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化能力與其對(duì)機(jī)體內(nèi)自由基的清除密切相關(guān)，是抗氧化食品、保健品、化妝品原料的良好來源[13?15]，培養(yǎng)高抗氧化功能的蛹蟲草產(chǎn)品，可為蛹蟲草的開發(fā)利用提供新的商業(yè)市場(chǎng)。然而，蛹蟲草無性型液體發(fā)酵代謝產(chǎn)物產(chǎn)量及其抗氧化活性的高低在很大程度上取決于蛹蟲草菌種的生理生化活力，因而生產(chǎn)上迫切需要建立高抗氧化能力的蛹蟲草優(yōu)良菌種評(píng)價(jià)篩選方法。目前，食用菌菌種的評(píng)價(jià)方法主要有分子生物學(xué)評(píng)價(jià)、試驗(yàn)評(píng)價(jià)以及生理生化評(píng)價(jià)方法[16]。盡管蛹蟲草可以實(shí)現(xiàn)人工栽培，但生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，通過結(jié)實(shí)性實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)蛹蟲草菌種質(zhì)量費(fèi)時(shí)費(fèi)力；通過生理生化方法評(píng)價(jià)、鑒定蛹蟲草菌種具有實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是較為切實(shí)可行的方法之一。為篩選出抗氧化綜合能力強(qiáng)、高活力、生物學(xué)轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)良菌株，本試驗(yàn)以10 株蛹蟲草菌株為研究對(duì)象，以菌株生長(zhǎng)活力、發(fā)酵液胞外酶活力、抗氧化能力為指標(biāo)，在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上建立線性回歸方程，確定定向篩選模型，創(chuàng)新確定有效評(píng)價(jià)蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力的方法，并通過結(jié)實(shí)性試驗(yàn)中的蛹蟲草生物學(xué)轉(zhuǎn)化率、子實(shí)體形態(tài)、蟲草素含量、生長(zhǎng)周期等指標(biāo)對(duì)模型進(jìn)行可行性驗(yàn)證分析，以期為蛹蟲草的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

供試蛹蟲草菌株共10 株，種屬均為蛹蟲草（Cordycepsmilitaris）。供試菌株編號(hào)、品種及來源如表1所示。

表1 蛹蟲草供試菌株Table 1 Tested strains of Cordyceps militaris

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA 平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維生素B110 mg，瓊脂15 g，pH 值自然，水1 000 mL。121 ℃高溫高壓滅菌保持30 min。

液體搖瓶培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，維生素B110 mg，pH 值自然，水1 000 mL。121 ℃高溫高壓滅菌保持30 min。

栽培培養(yǎng)基所需營(yíng)養(yǎng)液：MgSO41.0 g，KH2PO42.0 g，維生素B15 mg，配制成1 000 mL 溶液，備用。

麥粒培養(yǎng)基：650 mL 罐頭瓶，每瓶裝小麥粒35 g，麥?！脿I(yíng)養(yǎng)液=1∶1.7（g/mL）。用聚乙烯膜包裹瓶口，再用橡皮筋扎緊，于121 ℃下滅菌1 h，冷卻，備用。

1.1.3 試劑

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸鈉緩沖液（pH5.8，0.1 mol/L）：上海源葉生物科技有限公司；乙醇、葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、絡(luò)氨酸、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉（分析純）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3，5 二硝基水楊酸（3，5?dinitrosalicylic acid，DNS）顯色劑（分析純）：廈門海標(biāo)科技有限公司；乙腈（色譜純）：天津星馬克科技發(fā)展有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T?AOC）測(cè)定試劑盒、1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?di?phenyl?2?picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測(cè)定試劑盒、羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力試劑盒、2，2′?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzothiazoline?6?sulfonic acid），ABTS]、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer sa?line，PBS）：蘇州格銳思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BHC?1300IIA/B2 生物安全柜：上海力申科學(xué)儀器有限公司；SPH?2102 立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BCD?649WADV 冰箱：青島海爾股份有限公司；SPX?4501 生化培養(yǎng)箱：中儀國(guó)科（北京）科技有限公司；LDZX?75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；2695 高效液相色譜儀、2489 二極管陣列檢測(cè)器：沃特世科技（上海）有限公司；USUXA42508 C18 色譜柱（5μm，4.6 mm×250 mm）：安捷倫科技（上海）有限公司；KQ?50DA 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；723N 可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；HH?2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州市江南實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定

制備PDA 平板培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿直徑90 mm），用打孔器取直徑6 mm 的相同菌齡菌絲塊，接種于PDA 培養(yǎng)基中部，置于（18±1）℃黑暗培養(yǎng)，十字交叉法劃線，當(dāng)菌落直徑達(dá)到2 cm 時(shí)，在菌落邊緣畫線作為菌絲生長(zhǎng)起始線，當(dāng)生長(zhǎng)最快的菌株即將長(zhǎng)滿PDA 平板時(shí)取出所有的培養(yǎng)皿，在菌落邊沿畫終止線，用游標(biāo)卡尺測(cè)量起始線與終止線之間的距離（不同方向測(cè)3 次，取平均值，精確到0.02 mm），將此距離除以培養(yǎng)時(shí)間（d）即為菌絲平均生長(zhǎng)速度。記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)及轉(zhuǎn)色后色澤，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.3.2 發(fā)酵生物量的測(cè)定

液體搖瓶發(fā)酵：250 mL 錐形瓶中倒入100 mL 液體培養(yǎng)基，121 ℃高溫高壓滅菌30 min，冷卻備用；用打孔器取直徑6 mm 的平板培養(yǎng)基中相同菌齡菌絲塊，接種量為每瓶接種3 塊菌絲塊，于18 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5～6 d，待長(zhǎng)勢(shì)最好的菌株發(fā)酵菌球豐富、黏稠后停止培養(yǎng)，用多層紗布過濾，濾液備用，用蒸餾水將沉淀清洗3 次后，收集菌絲體，置于烘箱烘干（55 ℃）至恒重，稱重。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

1.3.3 供試樣品液前處理

將1.3.2 中供試菌株發(fā)酵液的備用濾液于4 ℃、8 000 ×g離心10 min，取上清液移入新的離心管，0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到胞外樣品液，用于胞外酶活力、抗氧化活性的測(cè)定。

1.3.4 β?葡萄糖苷酶活力測(cè)定

參照張曦文等[17]的測(cè)定方法，以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為Y=1.091 1X-0.034 8（R2=0.996 1）。于540 nm 處分別測(cè)定不同供試菌株胞外樣品液的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算胞外樣品液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，并計(jì)算酶活力。酶活單位規(guī)定為每秒鐘生成1 mmol/mL 的葡萄糖為一個(gè)酶活單位（U）。

1.3.5 蛋白酶活力測(cè)定

參照肇瑩等[18]的測(cè)定方法，以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為Y=1.336 4X+0.007 3（R2=0.999 8）。于680 nm處分別測(cè)定不同供試菌株胞外樣品液的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算胞外樣品液中酪氨酸的質(zhì)量濃度，并計(jì)算酶活力。酶活單位規(guī)定為1.0 mL 培養(yǎng)液中的酶量每秒鐘作用于底物釋放出酪氨酸的質(zhì)量（μg）為1 個(gè)活力單位（U）。

1.3.6 淀粉酶活力測(cè)定

試管中加入1.5 mL 的0.5% 可溶性淀粉溶液（用pH5.8，0.1 mol/L 乙酸鈉緩沖液配制）作為底物，加入0.5 mL 胞外樣品液，混勻，38 ℃恒溫水浴保溫30 min，取出后立即加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水定容至10 mL，混勻，于540 nm 處測(cè)吸光度。以煮沸10 min 的粗酶液作對(duì)照。以每毫升樣品中的酶量與底物反應(yīng)每分鐘內(nèi)改變0.01 個(gè)OD 值為一個(gè)活力單位（U）。淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=1.110 7X+0.075 2（R2=0.998 8）。

1.3.7 抗氧化能力測(cè)定

1.3.7.1 總抗氧化能力測(cè)定

參考試劑盒使用說明，利用總抗氧化能力（T?AOC）測(cè)定試劑盒（ABTS 法）對(duì)供試樣品液進(jìn)行總抗氧化能力的測(cè)定，按照公式（1）計(jì)算供試樣品液總抗氧化能力（T，μmol Trolox/mL）。

式中：A測(cè)定為樣品ABTS 的吸光度；A對(duì)照為樣品與PBS 混合液吸光度；A空白為ABTS 工作液與PBS 混合液的吸光度；D表示樣品的稀釋倍數(shù)。

1.3.7.2 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參考試劑盒使用說明，利用DPPH 自由基清除能力測(cè)定試劑盒對(duì)供試樣品液進(jìn)行DPPH 自由基清除率的測(cè)定。按照公式（3）計(jì)算供試樣品液的DPPH 自由基清除率（D，%）。

式中：A測(cè)定為樣品與DPPH 混合液吸光度；A對(duì)照為樣品與無水乙醇混合液吸光度；A空白為DPPH 與無水乙醇混合液吸光度。

1.3.7.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

參考試劑盒使用說明，利用超氧陰離子自由基清除能力試劑盒進(jìn)行超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定，按照公式（4）計(jì)算供試樣品的超氧陰離子自由基清除率（S，%）。

式中：A測(cè)定為測(cè)定管的吸光度；A對(duì)照為對(duì)照管的吸光度；A空白為空白管的吸光度。

1.3.7.4 羥自由基清除率測(cè)定

參考試劑盒使用說明，利用羥自由基清除能力測(cè)定試劑盒進(jìn)行羥自由基清除率的測(cè)定，按照公式（5）計(jì)算供試樣品的羥自由基清除率（H，%）。

式中：A測(cè)定為測(cè)定管的吸光度；A對(duì)照為對(duì)照管的吸光度；A空白為空白管的吸光度。

1.3.8 模型的驗(yàn)證

對(duì)10 株蛹蟲草供試菌株進(jìn)行小麥基質(zhì)人工培養(yǎng)[19]，并對(duì)菌株主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。將蛹蟲草液體菌種按照8 mL/瓶接種于麥粒培養(yǎng)基中，栽培條件：菌絲生長(zhǎng)階段18 ℃避光培養(yǎng)8～10 d，待菌絲長(zhǎng)滿基質(zhì)后進(jìn)行原基誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為300 lx 光照24 h、溫度20 ℃、空氣相對(duì)濕度不低于60%、二氧化碳濃度0.5%，當(dāng)培養(yǎng)至20 d 左右，菌絲由白色變成均勻的橘黃色，且形成針尖狀原基時(shí)，用滅菌后的接種針在封口膜上扎眼通氣（一般扎2 排孔，每排扎3 個(gè)直徑約2 mm的小孔即可），進(jìn)入子實(shí)體培養(yǎng)階段，當(dāng)培養(yǎng)60 d 左右時(shí)，采收子實(shí)體，記錄子實(shí)體性狀，計(jì)算生物學(xué)轉(zhuǎn)化率、菌種生長(zhǎng)周期，測(cè)定蟲草素含量。

1.3.9 蟲草素含量測(cè)定

參考NY/T 2116—2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測(cè)定高效液相色譜法》[20]測(cè)定蛹蟲草子實(shí)體提取液中蟲草素含量。色譜條件：柱溫35 ℃；流動(dòng)相，5%乙腈，95%水；流速1.0 mL/min；檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)18 min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量10μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，去離子水溶解，用流動(dòng)相定容至100 mL 搖勻，配成濃度為100μg/mL 蟲草素準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?zhǔn)確吸取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、12.50 mL于25 mL 容量瓶中，用去離子水定容，搖勻，濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾。每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進(jìn)樣3 次，得到相應(yīng)峰面積，計(jì)算平均值。以蟲草素的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得到蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線y=34 479x+10 846（R2=0.998 3）。

樣品中蟲草素含量測(cè)定：將供試蛹蟲草子實(shí)體于55 ℃干燥至恒重，粉碎，過80 目篩，分析天平準(zhǔn)確稱?。?.50±0.01）g 于刻度管中，按照液料比20︰1（mL/g）加入70% 乙醇，在60 ℃條件下超聲提取3 h，70% 乙醇定容至25 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到蛹蟲草子實(shí)體提取液，按照上述高效液相色譜法分析，重復(fù)進(jìn)樣3 次，得到相應(yīng)峰面積，計(jì)算平均值，并帶入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蟲草素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

所有結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長(zhǎng)活力

2.1.1 菌株生長(zhǎng)特性及發(fā)酵生物量

供試蛹蟲草菌株菌絲生長(zhǎng)速度和發(fā)酵生物量結(jié)果見圖1，菌株的菌落形態(tài)見圖2。

圖1 蛹蟲草菌株的菌絲生長(zhǎng)速度和發(fā)酵生物量Fig.1 Mycelial growth rate and fermentation biomass of Cordyceps militaris strain

圖2 蛹蟲草菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of Cordyceps militaris strain

由圖1 可知，10 株蛹蟲草供試菌株菌絲生長(zhǎng)速度相差較大，其中CH?1、CA?1 明顯快于其他菌株，菌絲生長(zhǎng)速度為其他菌株的2 倍多，其次為CX?4、CY?1、CB?1、CX?3、CS?1，而CS?2、CX?1、CD?1 長(zhǎng)速最慢；從發(fā)酵生物量看，CH?1、CA?1 要高于其他8 株菌株，其次為CX?4、CB?1、CS?2、CX?3、CX?1、CY?1、CD?1，CS?1 發(fā)酵生物量最低。由圖2 可知，在菌落狀態(tài)方面，轉(zhuǎn)色前，10 株供試菌株菌絲致密，呈絨毛狀，菌落顏色為白色，轉(zhuǎn)色后，除菌株CS?2、CX?1、CD?1 菌落形態(tài)為稀疏淺黃色外，其他7 株菌株菌落顏色為黃色至橘黃色，其中CX?4、CY?1、CB?1、CS?1、CX?3 菌落為黃色，CH?1、CA?1菌落為橘黃色，菌絲致密絨毛狀，長(zhǎng)勢(shì)較好。綜合以上分析初步得到菌株CH?1、CA?1 在菌絲生長(zhǎng)速度、菌落狀態(tài)、發(fā)酵生物量方面明顯優(yōu)于其他菌株。

2.1.2 菌株胞外酶活力

食用菌在生長(zhǎng)發(fā)育過程中產(chǎn)生胞外酶，食用菌胞外酶可以將天然谷物、木料等培養(yǎng)料中的糖類、蛋白質(zhì)等大分子轉(zhuǎn)化成利于吸收的小分子物質(zhì)，為其菌絲生長(zhǎng)、原基分化、子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[21]。10 株供試菌株胞外酶活力見圖3。

圖3 供試菌株胞外酶活力Fig.3 Extracellular enzyme activity of tested strains

由圖3 可知，供試10 株菌株發(fā)酵液胞外酶活力差異較大，CA?1 的β?葡萄糖苷酶酶活力明顯高于其他菌株，CH?1、CS?2、CX?4、CS?1、CX?3、CY?1、CB?1 次之，CD?1、CX?1 最低；CH?1 蛋白酶活力最高，CA?1、CS?2、CS?1、CB?1、CY?1、CD?1、CX?3 次之，CX?4、CX?1 活性最低；CX?1 淀粉酶活性最強(qiáng)，CA?1、CH?1、CS?1、CY?1、CX?4、CX?3、CB?1、CD?1、CS?2 活性依次降低。

2.2 菌株抗氧化能力

10 株供試蛹蟲草菌株胞外樣品液羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總抗氧化能力結(jié)果見圖4。

圖4 供試菌株抗氧化能力Fig.4 Antioxidant activity of tested strains

由圖4 可知，CH?1 的羥自由基清除率超過了60%，明顯高于其他菌株；CA?1 的超氧陰離子自由基清除率最高，其次是CH?1、CD?1、CS?1；CX?4、CS?2 的DPPH 自由基清除率較高，CB?1、CH?1 次之；總抗氧化能力方面，CH?1、CA?1、CY?1 表現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢(shì)。

2.3 抗氧化綜合能力與生長(zhǎng)活力指標(biāo)的相關(guān)性分析及模型建立

隸屬函數(shù)是用于表征模糊集合的數(shù)學(xué)工具，為了能夠更簡(jiǎn)單直觀的表達(dá)供試蛹蟲草菌株的抗氧化綜合能力，對(duì)羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH 自由基清除率和總抗氧化能力采用隸屬函數(shù)值法進(jìn)行賦值計(jì)算，得到平均隸屬函數(shù)值，結(jié)果見表2。隸屬函數(shù)值的范圍為0～1，數(shù)值越大說明該菌株的抗氧化綜合能力越高。這里定義平均隸屬函數(shù)值代表蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力。

表2 供試菌株隸屬函數(shù)值計(jì)算表Table 2 Calculation of membership function value of tested strains

使用SPSS 軟件對(duì)10 株蛹蟲草菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、搖瓶發(fā)酵生物量、胞外酶活力和抗氧化綜合能力進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

表3 蛹蟲草10 菌株指標(biāo)相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of indicators of Cordyceps militaris strain 10

由表3 可知，抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），發(fā)酵生物量與菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），菌絲生長(zhǎng)速度與β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），β?葡萄糖苷酶活力與蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），淀粉酶活力與各活性指標(biāo)有一定相關(guān)性。

為了進(jìn)一步闡明10 個(gè)蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力之間的內(nèi)在聯(lián)系，采用多元線性回歸方法分析各解釋變量的影響程度，決定具有代表性的指標(biāo)對(duì)抗氧化綜合能力的解釋水平。以抗氧化綜合能力作為因變量，以發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力為自變量，建立多元線性數(shù)學(xué)模型，模型公式如公式（6）所示。

式中：BY為蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力；BFER為發(fā)酵生物量，g/100 mL；BCMD為菌絲平均生長(zhǎng)速度，cm/d；BGLU為β?葡萄糖苷酶活力，U；BPRO為蛋白酶活力，U；A0為常數(shù)；A1、A2、A3、A4為變量系數(shù)。

運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果見表4。

表4 多元線性回歸分析Table 4 Multiple linear regression analysis

由表4 顯著性分析可知，菌絲平均生長(zhǎng)速度、發(fā)酵生物量、蛋白酶活力、β?葡萄糖苷酶活力對(duì)蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力的貢獻(xiàn)程度依次遞減，這些變量具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)回歸模型，可以得到蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲平均生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力的數(shù)學(xué)模型，線性方程如公式（7）所示。

所有的指標(biāo)中對(duì)蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力貢獻(xiàn)最大的是菌絲平均生長(zhǎng)速度，其次分別是發(fā)酵生物量、蛋白酶活力、β?葡萄糖苷酶活力。因此，可以根據(jù)此模型來快速篩選出具有高抗氧化綜合能力的蛹蟲草菌株：即通過比較菌絲的平均生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)狀況，初步篩選出菌絲生長(zhǎng)快、致密、顏色鮮黃的菌株，然后通過比較菌株的搖瓶生物量，篩選出發(fā)酵生物量較高的菌株，最后測(cè)定菌株的蛋白酶活力、β?葡萄糖苷酶酶活力，從而篩選出具有高抗氧化綜合能力的蛹蟲草菌株。

2.4 模型的驗(yàn)證

對(duì)10 株蛹蟲草供試菌株進(jìn)行小麥基質(zhì)人工培養(yǎng)，并對(duì)菌株主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，驗(yàn)證栽培優(yōu)勢(shì)菌株與模型選擇的優(yōu)勢(shì)菌株是否一致。10 株蛹蟲草菌株子實(shí)體生物學(xué)性狀和外觀見表5 和圖5。

圖5 10 株蛹蟲草菌株子實(shí)體生長(zhǎng)圖Fig.5 Growth of fruiting bodies of 10 Cordyceps militaris strains

表5 菌株子實(shí)體生物學(xué)性狀Table 5 Biological characteristics of fruiting bodies of strains

由表5、圖5 可知，菌株CH?1 與CA?1 子實(shí)體形成能力強(qiáng)、農(nóng)藝性狀優(yōu)良，子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，CS?1、CS?2、CX?3、CX?4 子實(shí)體生物學(xué)轉(zhuǎn)化率達(dá)到50% 以上，CB?1、CD?1、CX?1、CY?1 菌株較差，子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率在50%以下；蛹蟲草CH?1、CA?1 菌株蟲草素含量較野生菌株（CX?4、CS?2、CX?1）高60%左右，菌株生長(zhǎng)周期短10 d 左右，綜合子實(shí)體性狀、生物轉(zhuǎn)化率等指標(biāo)，蛹蟲草CH?1、CA?1 菌株為優(yōu)勢(shì)菌株，與模型選擇的菌株一致，表明抗氧化綜合能力高的菌株子實(shí)體農(nóng)藝性狀也較好，說明模型具有一定可行性。

3 討論與結(jié)論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的提高，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)蛹蟲草的需求量急劇增加。研究表明，蛹蟲草發(fā)酵菌絲體也具有良好的生物活性，所以采用液體發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體是滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求的有效途徑，而發(fā)酵獲得的蛹蟲草菌絲體的產(chǎn)量及其抗氧化能力的高低在很大程度上決定了蛹蟲草菌種的優(yōu)劣[21]。菌種優(yōu)劣的評(píng)價(jià)通常采取出菇試驗(yàn)來進(jìn)行，但由于受多種因素影響，導(dǎo)致出菇試驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果不穩(wěn)定，并且實(shí)驗(yàn)成本較高，周期比較長(zhǎng)。目前，已有一些可以方便快捷評(píng)價(jià)菌種質(zhì)量的相關(guān)報(bào)道：宋好倩[22]研究發(fā)現(xiàn)淀粉酶與蛹蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)呈正相關(guān)，纖維素酶和淀粉酶活性在轉(zhuǎn)色期達(dá)到峰值；楊歡東[23]研究發(fā)現(xiàn)異硫氰酸烯丙酯（allyl?isothiocyanate，AITC）處理能夠有效保持SOD 酶活較高活性，提高鐵離子抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）值、DPPH自由基清除能力和ABTS 陽離子自由基清除能力；劉淑琴等[24]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草子實(shí)體的產(chǎn)量與液體菌種的氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）酶活力呈正相關(guān)。

雖然相關(guān)研究對(duì)于蛹蟲草菌種質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義，但從總體上來講，研究方法相對(duì)單一，難以綜合反映蛹蟲草菌株的生長(zhǎng)活性和抗氧化活性的問題。本研究通過測(cè)定蛹蟲草菌株的菌絲生長(zhǎng)活力、相關(guān)酶活及清除自由基等指標(biāo)，對(duì)10 株供試菌株進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)，得到相關(guān)性分析結(jié)果：抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；發(fā)酵生物量與菌絲生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；菌絲生長(zhǎng)速度與β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；β?葡萄糖苷酶活力與蛋白酶活力呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；這些生理生化指標(biāo)可以作為蛹蟲草優(yōu)良菌株篩選的重要指標(biāo)。采用相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件建立得到了蛹蟲草菌株抗氧化綜合能力與發(fā)酵生物量、菌絲平均生長(zhǎng)速度、β?葡萄糖苷酶活力、蛋白酶活力的數(shù)學(xué)模型，可以根據(jù)此模型來快速篩選出具有高抗氧化綜合能力的蛹蟲草菌株，克服了以往蛹蟲草菌株活力評(píng)價(jià)相關(guān)報(bào)道的單一性，通過結(jié)實(shí)性實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，表明抗氧化綜合能力高的菌株具有很好的子實(shí)體農(nóng)藝性狀和生物轉(zhuǎn)化率，說明模型具有一定可行性，也為蛹蟲草優(yōu)良菌種選育提供了一定的參考。