黃友美，曹盛，孫一斐，李詩敏，夏雪雪，袁干軍*

（1.江西農業(yè)大學生物技術藥物研發(fā)工程中心，江西南昌 330045；2.江西農業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌 330045）

維生素K2又稱為甲基萘醌（menaquinone，MK），是甲基萘醌母環(huán)和3 號位上可變側鏈異戊二烯相連所產(chǎn)生的一系列同系物的總稱，用MK?n（n=1～14）表示，n為側鏈異戊二烯數(shù)目[1]。維生素K2是人體所必需的一類重要的脂溶性維生素，研究表明其在骨質疏松、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、癌癥等疾病的治療方面發(fā)揮著重要作用[2?6]。近年來，維生素K2的安全性和可靠性已經(jīng)得到各國權威機構的認證。2001年日本首先批準了維生素K2作為治療骨質疏松的藥物[7]，2008年美國批準維生素K2作為食品和強化食品添加劑，2009年歐洲食品安全局允許將維生素K2添加到食品中[8]，2016年我國開始允許維生素K2作為食品營養(yǎng)強化劑添加到兒童和孕產(chǎn)婦用的調制乳粉中[9]。維生素K2的來源包括從動物、植物或食品中提取，化學合成和微生物生產(chǎn)。由于天然來源的維生素K2含量很低，化學合成法已被用于維生素K2的工業(yè)化生產(chǎn)，但其存在產(chǎn)物活性低、易產(chǎn)生副產(chǎn)物以及污染環(huán)境等缺點[10]。相對而言，微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2具有發(fā)酵原料易得、成本低、反應溫和以及產(chǎn)物半衰期更長等優(yōu)勢[11]，因此利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)維生素K2具有廣闊的應用前景。

研究發(fā)現(xiàn)不同菌株能產(chǎn)生不同類型的維生素K2。一些腸道細菌如乳酸菌能產(chǎn)MK?5～MK?10 的MK 同系物[12]；枯草芽孢桿菌能產(chǎn)MK?4～MK?8 的MK 同系物，其中MK?7 占大多數(shù)[13]；黃桿菌屬主要產(chǎn)MK?4 和MK?6[14?15]。同時，一些新菌株也被發(fā)現(xiàn)能夠合成MK系列化合物，如MK?8、MK?9、MK?10[16?18]。目前，研究發(fā)現(xiàn)的所有維生素K2產(chǎn)生菌中，芽孢桿菌由于具有較長的安全使用歷史和高產(chǎn)MK?7 能力，被認為是微生物發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2的潛在菌株。在MK 同系物中，MK?7 由于在血液中半衰期較長且生物利用度高，是目前研究最多的維生素K2形式[19]。研究發(fā)現(xiàn)不同類型的維生素K2同系物的生理活性和生物利用度存在差異[20]，因此獲得維生素K2一系列同系物并探索其藥理活性和構效關系可為利用維生素K2精準治療疾病提供理論依據(jù)。目前大多數(shù)研究集中在優(yōu)化維生素K2產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件以提高MK?7 產(chǎn)量。Berenjian 等[21]優(yōu)化納豆芽孢桿菌發(fā)酵條件后MK?7 最大濃度可達到（62.32±0.34）mg/L。湯貴祥等[22]優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件后該菌株合成MK?7 的最高產(chǎn)量達到70 mg/L以上。目前尚無通過優(yōu)化發(fā)酵條件以增加微生物產(chǎn)維生素K2同系物多樣性相關研究。

前期建立了高效液相色譜?紫外（high performance liquid chromatography?ultraviolet，HPLC?UV）篩選法篩選得到一株維生素K2產(chǎn)生菌枯草芽孢桿菌DC?1 且能分析產(chǎn)MK 同系物種類[23?24]。在此基礎上，本研究首先通過單因素試驗考察培養(yǎng)基組分對枯草芽孢桿菌DC?1 產(chǎn)MK 多樣性和MK?7 產(chǎn)量的影響，進行Plackett?Burman（PB）試驗篩選顯著影響因素，再以MK?7 產(chǎn)量為響應值，利用響應面試驗設計確定最佳產(chǎn)維生素K2發(fā)酵條件，旨在為微生物發(fā)酵法合成維生素K2的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考意義以及探索維生素K2同系物的生理功能和構效關系提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌DC?1 由江西農業(yè)大學生物科學與工程學院生物技術藥物研發(fā)工程中心前期分離、篩選、鑒定并保藏，GeneBank 序列ID 為MG266437.1。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

維生素K3（MK?0）標準品（≥99.8%）：默克化工技術（上海）有限公司；甲醇（色譜純）：西隴化工股份有限公司；異丙醇（色譜純）：德國SIMARK 公司；正己烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、玉米漿、葡萄糖糖蜜、黃豆粉、甘油、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4·3H2O、NaCl（均為分析純）：北京奧博星生物技術有限公司。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g、蛋白胨15 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、KH2PO41 g、K2HPO4·3H2O 2.5 g，水1 000 mL、pH7.0～7.2。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g、黃豆粉40 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、KH2PO41 g、NaCl 3 g，水1 000 mL、pH7.0～7.2。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（Waters e2695）、檢測器（2998e?PDA）：美國Waters 公司；C18 高效色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）：大連依利特分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機（SCIENTZ?10）：寧波新芝生物科技股份有限公司；質譜儀（TripleToF 5600?1）：美國AB SCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

將保藏的菌種接到種子培養(yǎng)基中，在37 ℃、110 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 作為種子液。并以1% 的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于pH7.0、37 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 d。

1.3.2 維生素K2標準曲線的繪制

參考文獻[24]的方法測定，在避光的條件下，稱取恒重的MK?0 標準品，置于10 mL 容量瓶中，用流動相甲醇∶異丙醇（4∶1，體積比）溶解、定容。試驗前搖勻后，過0.45μm 濾膜，所得濾液作為標準品儲備液。再用流動相將儲備液稀釋成濃度梯度為1、2、3、4、5、6、7 mg/L的標準曲線工作液，采用高效液相色譜儀在248 nm 波長處檢測峰面積。以MK?0 標準品的濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 維生素K2的提取與測定

菌株DC?1 的發(fā)酵培養(yǎng)物以4 000 r/min 的轉速離心10 min，收集菌體和菌液。菌體-18 ℃冷凍過夜，然后將冷凍干燥所得菌體研磨成粉末。稱取0.1 g 菌體加入萃取液A[甲醇∶異丙醇溶液（4∶1，體積比）]2 mL，渦旋振蕩1 min，超聲15 min，靜置過夜。將萃取液B[正己烷∶異丙醇溶液（2∶1，體積比）]加入到菌液中（4∶1，體積比），靜置過夜，收集上層液體（正己烷層），合并萃取液A 和萃取液B，40 ℃下減壓干燥，得到黃色油狀液體，于2 mL 容量瓶中用流動相定容，過0.45μm 微孔濾膜后作為樣品供試液，采用HPLC?UV法進行含量測定，整個過程在避光條件下完成。HPLC 條件為流動相：甲醇∶異丙醇=4∶1（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：248 nm。采用外標法，利用樣品中維生素K2的色譜峰面積計算含量。

1.3.4 維生素K2多樣性分析

根據(jù)課題組前期建立的HPLC?UV 篩選MK 產(chǎn)生菌法[18]獲取色譜峰的紫外吸收曲線，分析MK 類似物的種類。

1.3.5 產(chǎn)物液相色譜?質譜聯(lián)用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC?MS）驗證

收集高效液相中分離的MK 類似物的產(chǎn)物，使用高分辨率質譜分析產(chǎn)物結構。LC?MS 質譜條件：碰撞能量35 V，離子源溫度500 ℃，DuoSpray 離子源，陽離子模式，起始質量50 Da，最終質量1 250 Da。

1.3.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.6.1 碳源優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，以添加3 g 碳源進行優(yōu)化試驗，分別選取甘油、葡萄糖、糖蜜、甘油+葡萄糖（1∶1，質量比）、糖蜜+甘油（1∶1，質量比）、葡萄糖+糖蜜（1∶1，質量比）、葡萄糖+糖蜜+甘油（1∶1∶1，質量比）7 組碳源進行單因素試驗，其余發(fā)酵條件保持不變。使用高效液相色譜分析MK 類似物種類并按照1.3.3 所述方法測定MK?7 的產(chǎn)量。

1.3.6.2 氮源優(yōu)化

在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上，以添加3 g 氮源進行優(yōu)化試驗，分別選取玉米漿、蛋白胨、黃豆粉、蛋白胨+黃豆粉（1∶1，質量比）、玉米漿+黃豆粉（1∶1，質量比）、蛋白胨+玉米漿（1∶1，質量比）、蛋白胨+玉米漿+黃豆粉（1∶1∶1，質量比）7 組氮源進行單因素試驗，其余發(fā)酵條件保持不變。使用高效液相色譜分析MK 類似物種類并按照1.3.3 所述方法測定MK?7 的產(chǎn)量。

1.3.6.3 無機鹽優(yōu)化

在添加最優(yōu)碳源和氮源條件下，對發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、NaCl 4 種無機鹽濃度進行優(yōu)化，4 種無機鹽的濃度梯度均設置為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/100 mL，按照1.3.3 所述方法測定MK?7 的產(chǎn)量。

1.3.7 Plackett?Burman 試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，以MK?7 產(chǎn)量為響應值，對甘油、糖蜜、蛋白胨、黃豆粉和玉米漿添加量5 個影響因素進行評價，篩選出主效應因子，每個因素取最低（-1）和最高（1）兩個水平，共12 組試驗。試驗因素和水平取值見表1。

表1 Plackett?Burman 試驗設計的因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett?Burman experimental design

1.3.8 響應面試驗

通過Plackett?Burman 設計篩選主效應因子，使用Design?Expert 軟件進行Box?Behnken 中心組合設計試驗，采用三因素三水平響應面法進行優(yōu)化，以甘油添加量、糖蜜添加量和黃豆粉添加量為自變量，MK?7 產(chǎn)量為響應值。試驗設計因素及水平見表2。

表2 Box?Behnken 試驗設計因素和水平Table 2 Factors and levels of Box?Behnken experimental design

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，單因素試驗使用Origin 8.5 軟件作圖，Plackett?Burman 試驗和響應面試驗采用Design?Expert 11 進行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結果與分析

2.1 維生素K2 定量與定性檢測

以MK?0 標準品的濃度為橫坐標，在248 nm 波長下對應峰面積為縱坐標得到相關線性方程為y=133 066.8x+11 302.4（r=0.999 8）。依據(jù)維生素K2結構特征，以MK?0 標準曲線為基礎，乘以校正因子即相對分子質量的比值[25]，得到MK?7 標準曲線為y=（133 066.8x+11 302.4）×（648.490 6/172.052 4）（r=0.999 8），該線性方程可用來計算樣品中MK?7 的濃度。

DC?1 菌株發(fā)酵液中初步確定為MK 類似物的色譜峰分析驗證結果如圖1所示。

圖1 產(chǎn)物MK?7 質譜圖Fig.1 Mass spectrum of product MK?7

由圖1 可知，正離子模式下特征峰分子量為649.501 9，與正離子下MK?7 相對分子質量一致，可確定其為MK?7。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 碳源對枯草芽孢桿菌DC?1 合成MK 的影響

葡萄糖、糖蜜、甘油及混合碳源（甘油+葡萄糖、糖蜜+甘油、葡萄糖+糖蜜、葡萄糖+糖蜜+甘油）對MK?7產(chǎn)量和MK 多樣性的影響如圖2所示。

圖2 碳源對DC?1 合成MK 影響Fig.2 Effect of carbon source on MK synthesis by DC?1

研究表明，甘油是合成MK?7 的最優(yōu)碳源[13，26?27]，但由圖2（A）可知，使用糖蜜+甘油（1∶1，質量比）作為混合碳源時，最有利于MK?7 的積累。由圖2（B）可知，糖蜜作為碳源時，可以增加菌株DC?1 產(chǎn)MK 類似物的種類至5 種。糖蜜作為制糖業(yè)的副產(chǎn)品，含有大量的可發(fā)酵糖且成分復雜，可為微生物生長提供豐富的營養(yǎng)成分，這可能是它作為碳源增加DC?1 產(chǎn)MK 類似物的種類的原因，且其價格便宜，是適合微生物生長的良好碳源[28]。從MK?7 產(chǎn)量、MK 多樣性以及成本方面綜合考慮，選用糖蜜+甘油的組合作為菌株發(fā)酵的碳源。

2.2.2 氮源對枯草芽孢桿菌DC?1 合成MK 的影響

蛋白胨、玉米漿、黃豆粉及混合氮源（蛋白胨+黃豆粉、玉米漿+黃豆粉、蛋白胨+玉米漿、蛋白胨+玉米漿+黃豆粉）對MK?7 產(chǎn)量和MK 多樣性的影響如圖3所示。

圖3 氮源對DC?1 合成MK 影響Fig.3 Effect of nitrogen source on MK synthesis by DC?1

由圖3（A）可知，蛋白胨作為氮源時MK?7 產(chǎn)量最高，這與Berenjian 等[21]的研究結果一致。當使用玉米漿+黃豆粉+蛋白胨（1∶1∶1，質量比）組合氮源時，MK?7產(chǎn)量略低于單獨使用蛋白胨；由圖3（B）可知，黃豆粉作為氮源時可以增加菌株DC?1 產(chǎn)MK 類似物的種類。玉米漿含有較為豐富的可溶性蛋白質且成本較為廉價，是適合微生物生長的良好氮源之一[29]。大豆粉不僅含有豐富的蛋白質和糖類，還含有磷、鈣、鎂和其他微量元素[30]，這可能是它作為氮源能增加菌株DC?1 產(chǎn)MK 類似物的種類的原因。從MK?7 產(chǎn)量、MK 多樣性以及成本方面綜合考慮，選用玉米漿+黃豆粉+蛋白胨的組合作為氮源。

2.2.3 無機鹽濃度優(yōu)化

無機鹽在微生物的生長和次級代謝產(chǎn)物的合成中起到重要作用。NaCl 能維持菌體生長的滲透壓，KH2PO4、K2HPO4·3H2O 在培養(yǎng)基中起緩沖劑調節(jié)pH值的作用，Mg2+可能在異戊二烯側鏈和萘醌母環(huán)的連接起到穩(wěn)定作用，故選取KH2PO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O 和NaCl 4 種對菌株產(chǎn)MK 有較大影響的無機鹽考察其對MK?7 合成的影響，結果如圖4所示。

圖4 無機鹽添加量對MK?7 產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inorganic salt addition on MK?7 yield

由圖4 可知，4 種無機鹽均對MK?7 的合成具有一定影響，最優(yōu)添加濃度分別為KH2PO40.3 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 0.8 g/100 mL、MgSO4·7H2O 0.7 g/100 mL、NaCl 0.5 g/100 mL。當無機鹽濃度超過一定范圍后，菌體產(chǎn)MK?7 能力出現(xiàn)下降，這與之前文獻報道無機鹽對微生物生長的影響一致[31?32]。無機鹽對于微生物的生長和合成次級代謝產(chǎn)物具有重要影響，一般是無機鹽在濃度較低時對菌體生長有促進作用，在較高濃度時會抑制菌體生長。

2.3 Plackett?Burman 試驗設計

Plackett?Burman 試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 Plackett?Burman 試驗設計與結果Table 3 Plackett?Burman experimental design and results

表4 Plackett?Burman 試驗設計方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett?Burman experimental design

由表4 可知，影響MK?7 產(chǎn)量的關鍵因素重要性排序依次為甘油添加量（A）＞蛋白胨添加量（C）＞玉米漿添加量（E）＞糖蜜添加量（B）＞黃豆粉添加量（D），其中甘油添加量（A）對MK?7 產(chǎn)量的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.4 響應面優(yōu)化試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果

綜合考慮PB 試驗結果和單因素試驗對DC?1 產(chǎn)MK 多樣性的影響，選擇甘油添加量（A）、糖蜜添加量（B）和黃豆粉添加量（C）3 個關鍵因素進行響應面優(yōu)化設計和分析。Box?Behnken 試驗設計及結果見表5。

表5 Box?Behnken 試驗設計及結果Table 5 Box?Behnken experimental design and results

2.4.2 結果分析

利用Design?Expert 軟件對表5 數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到MK?7 產(chǎn)量為響應值的回歸方程：Y=95.33+1.51A+1.24B+1.03C+0.5175AB+2.43AC+2.89BC-7.72A2-5.63B2-3.76C2。對回歸方程進行方差分析，結果見表6。

表6 回歸方程的方差分析結果Table 6 Variance analysis results of regression equation

由表6 可知，回歸模型中二次項A2、B2對MK?7 產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），二次項C2和交互項BC對MK?7 產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05），其余項不顯著。對菌株DC?1 產(chǎn)MK?7 能力的影響大小順序為甘油添加量＞糖蜜添加量＞黃豆粉添加量。該回歸模型的P＜0.05，方程模型顯著，失擬項P=0.109 2，不顯著；模型的R2=0.944 0，R2Adj=0.872 0，變異系數(shù)=2.56%，以上參數(shù)說明該模型擬合程度較好，試驗誤差較小，該模型可用于本次試驗。

2.4.3 響應曲面分析

根據(jù)回歸方程繪制甘油添加量（A）、糖蜜添加量（B）、黃豆粉添加量（C）交互作用的響應曲面如圖5所示。

圖5 甘油、糖蜜、黃豆粉添加量的交互作用對MK?7 產(chǎn)量影響的響應曲面Fig.5 Response surface of interaction among glycerol，molasses，and soybean flour on MK?7 yield

由圖5 和方差分析結果可知，糖蜜添加量和黃豆粉添加量的交互作用對MK?7 產(chǎn)量的影響顯著，甘油和糖蜜、甘油和黃豆粉對MK?7 產(chǎn)量的影響不顯著。數(shù)學模型分析得到菌株DC?1 產(chǎn)MK?7 的最優(yōu)發(fā)酵條件為甘油添加量36.43 g/L、糖蜜添加量31.82 g/L、黃豆粉添加量32.54 g/L，理論響應值為95.685 mg/L。結合實際操作的便利性，對上述優(yōu)化結果處理后確定最優(yōu)發(fā)酵條件：甘油添加量36.5 g/L、糖蜜添加量31.8 g/L、黃豆粉添加量32.5 g/L。

2.4.4 驗證試驗結果

在最優(yōu)發(fā)酵條件下重復3 次獨立試驗以驗證預測值，MK?7 產(chǎn)量的平均值為94.66 mg/L，與理論響應值（95.685 mg/L）相差較小，說明通過響應面優(yōu)化后的發(fā)酵條件參數(shù)可靠，具有一定的實踐指導價值。與優(yōu)化前相比，MK?7 的最終產(chǎn)量提高了48.04%，且在該發(fā)酵條件下經(jīng)HPLC?MS 鑒定DC?1 能同時產(chǎn)5 種維生素K2同系物。

3 結論

本研究采用單因素試驗和Plackett?Burman 試驗設計，篩選得到甘油、糖蜜和黃豆粉添加量這3 個影響菌株DC?1產(chǎn)維生素K2的關鍵因素。再利用Box?Behnken 試驗設計得到最優(yōu)發(fā)酵條件為甘油添加量36.5 g/L、糖蜜添加量31.8 g/L、黃豆粉添加量32.5 g/L、KH2PO4濃度0.3 g/100 mL、K2HPO4·3H2O 濃度0.8 g/100 mL、MgSO4·7H2O 濃度0.7 g/100 mL、NaCl 濃度0.5 g/100 mL，在pH7.0，溫度37 ℃下靜置培養(yǎng)。在此條件下MK?7 產(chǎn)量為94.66 mg/L，較原始發(fā)酵條件提高了48.04%，實際值與響應面預測值吻合良好。同時在該發(fā)酵條件下菌株DC?1產(chǎn)維生素K2的多樣性增加，能同時產(chǎn)5 種維生素K2同系物，經(jīng)HPLC?MS 鑒定為MK?2、MK?3、MK?4 和MK?7，而其中一個類似物由于極不穩(wěn)定或其他原因，未能在高分辨率質譜中找到，根據(jù)保留時間推測其為MK?5 或MK?6。本研究為后續(xù)微生物發(fā)酵法合成維生素K2的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎，并為研究維生素K2一系列同系物的藥理活性和構效關系提供化合物來源。