余詠詩，夏映池，李楠，陳鑫，劉輝，，楊安平，范麗霞，*

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山 528225；2.佛山科學技術學院醫(yī)學院，廣東佛山 528000）

雞蛋花（PlumeriarubraL.）為夾竹桃科（Apocyna?ceae）雞蛋花屬（Plumeria）植物，又名緬梔子、鹿角樹等，原產(chǎn)于美洲熱帶地區(qū)，在我國主要分布于福建、廣東、廣西和海南等省區(qū)[1]。雞蛋花是嶺南地區(qū)常用藥食同源草藥，同時也是廣東著名涼茶“五花茶”的原料之一，其味甘、淡，性涼，具有清熱解毒和潤肺止咳的功效，人們常將其泡成茶水飲用從而達到預防中暑的目的[2?3]。目前，已從雞蛋花中分離得到環(huán)烯醚萜[4?5]、三萜[6]、揮發(fā)油[7]、黃酮[8]等化學成分?，F(xiàn)代藥理研究表明雞蛋花具有抗病毒[9]、抗菌[7]、鎮(zhèn)咳[10]等作用。

多酚類、黃酮類物質在抗炎[11]、抗氧化[12?13]、保肝[14?15]、抗腫瘤[16]等方面均具有較好的活性，在食品、調味品、保健和醫(yī)藥領域具有廣闊的應用前景。近年來，對雞蛋花的研究主要集中在雞蛋花藥理功效[17]、栽培技藝[18]和單一化學成分的分析上[3]，僅有少數(shù)研究關注雞蛋花的總黃酮及其抗氧化性。鄧金生等[19]研究雞蛋花的70%乙醇提取物的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)其提取液濃度為0.01 g/mL 時對DPPH 自由基的清除效率可達93.99%；陳遂等[20]通過超聲波?十二烷基硫酸鈉（so?dium dodecyl sulfate，SDS）協(xié)同提取雞蛋花總黃酮并測定其自由基清除能力，研究發(fā)現(xiàn)雞蛋花總黃酮具有良好的自由基清除效果，其中對羥自由基清除率最高。

目前對雞蛋花提取物中各萃取部位多酚和黃酮類含量、抗菌、抗腫瘤活性的研究較少，因此本試驗對雞蛋花不同溶劑萃取部位的總酚及總黃酮含量進行測定，并對其抗菌、抗氧化、抗腫瘤活性進行研究，旨在為雞蛋花的進一步開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋花：亳州鍵安堂有限公司；蘆丁對照品、沒食子酸標準品（色譜純度≥98%）：成都德思特生物技術有限公司；福林酚、亞硝酸鈉、氯化鈉、硝酸鋁、1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（1，1?diphenyl?2?picrylhydrazyl，DPPH）、2，2′?聯(lián)氮?二（3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸）二銨鹽[2，2′?azino?bis（3?ethylbenzoth?iazoline?6?sulfonic acid）diamm? onium salt，ABTS]、L?抗壞血酸、水楊酸、硫酸亞鐵、過硫酸鉀：上海麥克林生化科技有限公司；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇：天津市大茂化學試劑廠；細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit?8，CCK?8）：東仁化學科技（上海）有限公司。試驗所用水均為超純水，所用試劑均為分析純。

大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）：佛山市中醫(yī)院檢驗科。

人肝癌細胞（SMMC?7721，HepG2）、人神經(jīng)膠質瘤細胞（U251）、人乳腺癌細胞（MCF?7，MDA?MB?231）、人結腸癌細胞（HCT?116）、人結直腸腺癌上皮細胞（DLD?1）、人惡性黑色素瘤細胞（A375）：中國科學院上海細胞庫。

旋轉蒸發(fā)儀（YRE?2000B）：鞏義市予華儀器有限責任公司；萬分之一分析天平（JJ224BC）：常熟市雙杰測試儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH?4）：上海亞榮生化儀器廠；紫外分光光度儀（UV?2700）：日本島津公司；超聲波儀（JP?040S）：深圳市潔盟清洗設備有限公司；智能生化培養(yǎng)箱（LRH?150）：鄭州生元儀器有限公司；酶標儀（EPOCH）：美國BioTek 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

干燥雞蛋花100 g 置于45 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎后過60 目篩，用6 倍量95%乙醇回流提取3 次，減壓濃縮得到總提取物。用水將總提取物混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，分別減壓回收溶劑、干燥至恒重得到石油醚萃取物（2.3 g）、氯仿萃取物（1.8 g）、乙酸乙酯萃取物（1.5 g）、水層（5.2 g）。

1.2.2 樣品總酚含量測定

標準曲線的繪制參照文獻[21]，采用福林?酚比色法測定總酚含量。配制濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 沒食子酸標準溶液，分別精密量取各標準溶液0.1 mL 置于5 支試管中，加入0.5 mL 福林酚試劑和7.9 mL 水，反應5 min 后，加1.5 mL 的1 g/L 碳酸鈉溶液，避光放置2 h 后于765 nm 處測定吸光值。得到回歸方程為y=0.077x+0.007 4，R2=0.999 7。雞蛋花不同溶劑萃取物溶液按上述方法處理后測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算總酚含量，結果以每克干萃取物中毫克沒食子酸當量（gallic acid equivalents，GAE）表示（mg GAE/g）。

1.2.3 樣品總黃酮含量測定

采用三氯化鋁分光光度法[19]測定總黃酮含量。精密稱取12.5 mg 蘆丁標準品于50 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，得到濃度為0.25 mg/mL 的標準溶液。使用移液管移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 標準品溶液分別置于10 mL 容量瓶中，分別依次加入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL 無水乙醇，再依次加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后放置6 min，加入4 mL 10%氫氧化鈉溶液，混勻后放置6 min，最后加入80%乙醇溶液定容至刻度，搖勻放置15 min。用紫外分光光度儀于510 nm處測定吸光值，制作標準曲線，得到回歸方程為y=1.169 6x-0.014 3，R2=0.999 3。雞蛋花不同溶劑萃取物溶液按上述方法處理后測定吸光值，根據(jù)回歸方程計算總黃酮含量，總黃酮含量以每克干萃取物中毫克蘆丁當量（rutin equivalents，RE）表示（mg RE/g）。

1.2.4 抑菌活性測試

最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定采用微量肉湯稀釋法[22]。將雞蛋花不同極性萃取物用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液稀釋至1 mg/mL。無菌環(huán)境下，在96 孔板第1 孔加入1 mg/mL 不同極性萃取物200μL，2～12 孔分別加入100μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，從第1 孔吸取100μL 提取液至第2 孔，混勻后從中吸取100μL 到第3 孔，依此類推，對萃取物進行倍比稀釋，直至第10 孔，第10 孔吸取100 μL 棄去，使1～10孔濃度分別為1、0.5、0.25……0.003 906 25、0.001 953 125 mg/mL，從1～11 孔依次加入用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液稀釋1 000 倍的0.5 麥氏菌液100μL，以第11 孔為陽性對照觀察細菌的生長狀況，第12 孔補充100μL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液作為陰性對照以觀察孔內是否被污染，最終保持每孔液體體積為200μL。將96 孔板密封置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 h。最終以肉眼觀察到孔內澄清、不發(fā)生渾濁、沉淀的最小藥物濃度即為MIC。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH 自由基清除能力測定

參考文獻[23]方法，將150μL 0.1 mmol/L DPPH 溶液與50μL 不同濃度（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL）雞蛋花不同極性萃取物供試液置于96 孔板相同微孔充分混合，并在25 ℃避光條件下放置30 min，在517 nm 處測定吸光值。用等濃度的VC溶液作為陽性對照，根據(jù)下式計算雞蛋花不同極性萃取物對DPPH 自由基的清除率。

X=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：X為DPPH 自由基清除率，%；A0為等體積無水乙醇代替樣品的空白對照組的吸光值；A1為試驗組吸光值；A2為用等體積的無水乙醇代替DPPH 溶液的試驗對照組的吸光值。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除能力測定

根據(jù)Tang 等[24]方法配制ABTS 工作液：7 mmol/L ABTS 溶液與4.95 mmol/L 過硫酸鉀溶液（1∶1，體積比）混合，避光孵育12 h。將混合物用磷酸鹽緩沖液（phos?phate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH7.4）稀釋，使其在波長為734 nm 的條件下測定吸光值為0.70±0.02。150 μL ABTS 工作液與50 μL 不同濃度（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL）的雞蛋花不同極性萃取物供試液置于96 孔板相同微孔充分混合并在25 ℃避光條件下放置30 min，然后在734 nm 處測定吸光值。用等濃度的VC溶液作為陽性對照，根據(jù)下式計算雞蛋花不同極性萃取物對ABTS+自由基的清除率。

Y=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：Y為ABTS+自由基清除率，%；A0為等體積無水乙醇代替樣品的空白對照組的吸光值；A1為試驗組吸光值；A2為用等體積的無水乙醇代替ABTS 工作液的試驗對照組的吸光值。

1.2.5.3 羥自由基清除能力測定

參考王迦琦等[25]的反應體系模型：預先制備9.0 mmol/L FeSO4溶液、不同濃度（1 000、500、250，125、62.5、31.25、15.625 μg/mL）雞蛋花不同極性萃取物供試液、9.0 mmol/L 水楊酸?乙醇溶液和8.8 mmol/L 30%H2O2溶液。將上述溶液分別吸取50 μL 依次加入96 孔板相同微孔中充分均勻，25 ℃靜置30 min 后，在510 nm 處測定吸光值。用等濃度的VC溶液作為陽性對照，根據(jù)下式計算雞蛋花不同極性萃取物對羥自由基的清除率。

P=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：P為羥自由基清除率，%；A0為等體積無水乙醇代替樣品的空白對照組的吸光值；A1為試驗組吸光值；A2為用等體積的無水乙醇代替H2O2的試驗對照組的吸光值。

1.2.6 體外抗腫瘤活性測試

1.2.6.1 細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)參照文獻[26]。各細胞分別保存在含有10% 胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）和1% 青霉素/鏈霉素（dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）的培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5%CO2條件下保存。

1.2.6.2 體外抗腫瘤活性測定

參考Liu 等[27]方法，采用CCK?8 法測定不同濃度的雞蛋花不同極性萃取物對腫瘤細胞的抑制作用。人肝癌細胞（SMMC?7721，HepG2）、人神經(jīng)膠質瘤細胞（U251）、人乳腺癌細胞（MCF?7，MDA?MB?231）、人結腸癌細胞（HCT?116）、人結直腸腺癌上皮細胞（DLD?1）、人惡性黑色素瘤細胞（A375）分別接種于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，當孔板中細胞完全貼壁且處于對數(shù)生長期時，加入6 個質量濃度（0、3、10、30、100、300μg/mL）的雞蛋花不同極性萃取物供試液，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，每孔再加入10 μL CCK8 溶液，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，低速振蕩30 s，使用酶標儀檢測細胞在450 nm 處吸光值，計算細胞存活率（C，%）。

C=[（A1-A0）/（A2-A0）]×100

式中：A0為等體積含10%FBS 的培養(yǎng)基代替樣品的空白對照組的吸光值；A1為試驗組吸光值；A2為二甲基亞砜處理過的細胞的試驗對照組的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均平行操作3 次，試驗結果均表示為平均值±標準差，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 雞蛋花不同溶劑萃取物中總酚和總黃酮含量

雞蛋花不同溶劑萃取物總酚和總黃酮含量見表1。

表1 雞蛋花不同溶劑萃取物總酚和總黃酮含量Table 1 Total phenols and total flavonoids in different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

由表1 可知，雞蛋花4 種不同溶劑萃取物中總酚含量的排序為乙酸乙酯＞水＞氯仿＞石油醚，表明雞蛋花中水溶性多酚含量多于脂溶性多酚，在進行雞蛋花多酚提取時應選擇極性較大的溶劑。不同溶劑萃取物中總黃酮含量的排序為乙酸乙酯＞氯仿＞水＞石油醚。乙酸乙酯萃取物中總黃酮含量最高，石油醚、水和氯仿萃取物中總黃酮的含量均較低。綜上，乙酸乙酯部位中總酚與總黃酮的含量均較高，在富集雞蛋花總酚與總黃酮時，可選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

2.2 雞蛋花不同溶劑萃取物抗菌效果

雞蛋花不同溶劑萃取物對不同菌的抑菌作用如表2所示。

表2 雞蛋花不同溶劑萃取物對不同細菌的MICTable 2 MIC of different solvent extracts of Plumeria rubra L.against different bacteria

由表2 可知，石油醚萃取物、氯仿萃取物對5 種菌的MIC 均大于1 mg/mL，乙酸乙酯萃取物和水層萃取物對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的MIC 為0.5 mg/mL外，對其余3 種菌的MIC 均為1 mg/mL。由此表明，乙酸乙酯萃取物和水層萃取物在體外對大腸桿菌和銅綠假單胞菌有較好的抑制作用。

2.3 雞蛋花不同溶劑萃取物體外抗氧化效果

雞蛋花不同極性萃取物和VC對DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥自由基的清除效果見圖1～圖3。

圖1 雞蛋花不同溶劑萃取物對DPPH 自由基的清除率Fig.1 Scavenging of DPPH free radical by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

圖2 雞蛋花不同溶劑萃取物對ABTS+自由基的清除率Fig.2 Scavenging of ABTS+free radical by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

由圖1～圖3 可知，在濃度為15.625～1 000 μg/mL內，4 種不同極性雞蛋花萃取物隨著濃度的增加，對DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除率也逐漸遞增。當濃度超過500 μg/mL 時，除石油醚萃取物對DPPH 自由基、ABTS+自由基的清除率的增長速度并未減弱外，其余清除率增長速度明顯變緩。

IC50是評價抗氧化性的重要指標，抗氧化能力越強，其IC50越小。雞蛋花不同極性萃取物抗氧化活性的IC50見表3。

表3 雞蛋花不同極性萃取物抗氧化活性的IC50 值Table 3 IC50 of antioxidant activity by different solvent extracts of Plumeria rubra L.

由表3 可知，VC和雞蛋花4 種不同極性萃取物清除DPPH 自由基和ABTS+自由基能力由大到小均依次為VC＞乙酸乙酯＞氯仿＞水＞石油醚，清除羥自由基的能力由大到小依次為石油醚＞VC＞乙酸乙酯＞氯仿＞水。綜上，雞蛋花4 種不同極性萃取物中乙酸乙酯萃取物抗氧化效果最為顯著。當濃度達到1 000μg/mL，DPPH自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除率分別達到93.32%、95.70%、62.86%，其IC50值分別為14.94、15.43、74.61μg/mL。

2.4 雞蛋花不同溶劑萃取物體外抗腫瘤效果

雞蛋花不同溶劑萃取物對腫瘤細胞的抑制作用見圖4～圖11。

圖4 雞蛋花不同溶劑萃取物對SMMC?7721 生長抑制曲線Fig.4 Growth inhibition curves of SMMC?7721 by different sol?vent extracts of Plumeria rubra L.

圖5 雞蛋花不同溶劑萃取物對HepG2 生長抑制曲線Fig.5 Growth inhibition curves of HepG2 by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

圖6 雞蛋花不同溶劑萃取物對MDA?MB?231 生長抑制曲線Fig.6 Growth inhibition curves of MDA?MB?231 by different sol?vent extracts of Plumeria rubra L.

圖7 雞蛋花不同溶劑萃取物對MCF?7 生長抑制曲線Fig.7 Growth inhibition curves of MCF?7 by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

圖8 雞蛋花不同溶劑萃取物對DLD1 生長抑制曲線Fig.8 Growth inhibition curves of DLD1 by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

圖9 雞蛋花不同溶劑萃取物對HCT116 生長抑制曲線Fig.9 Growth inhibition curves of HCT116 by different solvent extracts of Plumeria rubra L.

圖10 雞蛋花不同溶劑萃取物對A375 生長抑制曲線Fig.10 Growth inhibition curves of A375 by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

圖11 雞蛋花不同溶劑萃取物對U251 生長抑制曲線Fig.11 Growth inhibition curves of U251 by different solvent ex?tracts of Plumeria rubra L.

由圖4～圖11 可知，石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取物和水層在0～300μg/mL 濃度下對8 種細胞均有不同程度的抑制作用。隨著藥物濃度的升高，細胞的存活率也相應降低，表明雞蛋花不同溶劑萃取物抑制腫瘤細胞的生長具有良好的劑量效應。其中氯仿萃取物對8 種腫瘤細胞的抑制作用最明顯，其次為乙酸乙酯、石油醚和水層。當濃度達到300 μg/mL 時，氯仿萃取物對MCF?7 和U251 的抑制率接近100%。

雞蛋花不同極性萃取物對應8 種腫瘤細胞的IC50值見表4。

表4 雞蛋花不同極性萃取物對應8 種腫瘤細胞的IC50 值Table 4 IC50 of different solvent extracts of Plumeria rubra L.against eight tumor cells

從表4 可以看出，不同腫瘤細胞對雞蛋花不同溶劑萃取物的敏感性均不同。氯仿萃取物對MDA?MB?231、A375 和HCT?116 的抑制作用較強，其IC50值分別為9.12、10.39、14.72μg/mL；乙酸乙酯萃取物對A375 的抑制作用最強，IC50值為29.76 μg/mL；石油醚萃取物對MDA?MB?231 的抑制作用最強，IC50值為75.38μg/mL；水層對各細胞48 h 的IC50值均大于300μg/mL。

3 討論與結論

本研究對雞蛋花95% 乙醇提取物不同極性萃取部位的總酚、總黃酮含量以及生物活性如體外抗菌、抗氧化、抗腫瘤進行分析。結果表明，在4 種極性萃取組分中，乙酸乙酯萃取物中總酚和總黃酮的含量最高，分別為（57.73±0.09）mg GAE/g、（558.88±0.99）mg RE/g。4 種極性萃取組分具有廣譜抑菌性和較強的抗氧化能力，而乙酸乙酯萃取物的抗菌、抗氧化效果最強。乙酸乙酯萃取物對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的MIC 為0.5 mg/mL，對其余3 種菌的MIC 為1 mg/mL。乙酸乙酯萃取物對DPPH 自由基、ABTS+自由基和羥自由基清除率分別高達93.32%、95.70%和62.86%，其抗氧化性幾乎能與VC媲美，因此可認為雞蛋花是天然的強抗氧化劑。綜上，雞蛋花的抗菌、抗氧化活性成分集中在乙酸乙酯極性部位，而該部位總酚和總黃酮的含量最高，且在一定質量濃度范圍內，其抗菌、抗氧化能力的大小和濃度之間存在明顯的量效關系。上述結論表明總酚與總黃酮含量與雞蛋花抗菌活性和抗氧化活性有較好的相關性，為了更好地研究雞蛋花多酚和黃酮類物質的抗菌、抗氧化性機制，可利用紫外分光光度計、高效液相色譜儀等對雞蛋花乙酸乙酯萃取物進一步的研究與分析。

而此次體外抗腫瘤活性實驗結果表明，石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取物和水層在0～300 μg/mL 濃度條件下對人肝癌細胞（SMMC?7721，HepG2)、人乳腺癌細胞（MDA?MB?231，MCF?7)、人結腸癌細胞（HCT?116)、人結直腸腺癌上皮細胞（DLD?1)、人惡性黑色素瘤細胞（A375)、人神經(jīng)膠質瘤細胞（U251)8 種細胞均有不同程度抑制作用。其中氯仿萃取物對8 種腫瘤細胞的抑制作用最明顯，其IC50值分別為18.78、30.68、9.12、23.89、14.72、40.14、10.39、23.50 μg/mL。然而，氯仿萃取物所含總酚與總黃酮并不是最高，這表明總酚與總黃酮含量與抗腫瘤活性作用可能相關性小。在相應研究中，雞蛋花氯仿萃取物除了多酚和黃酮物質外，還存在其他的多種化學成分，其對腫瘤細胞的抑制作用是否與多酚、黃酮含量相關，仍有待進一步對雞蛋花氯仿萃取物的成分進行研究。因此，通過深入研究雞蛋花氯仿部位的具體成分，確定其具有抗腫瘤活性的化學物質，對于開發(fā)雞蛋花為天然的藥物制劑具有重要意義。

本文從藥效學角度考察了雞蛋花不同極性部位具有的多種生物活性，而且由于雞蛋花易于收集，成本相對較低，因此將雞蛋花開發(fā)成為食品、保健品或者藥品的前景廣闊，可進行深入研究。