鮑清華 夏輝 楊煜潔 黃小容

摘 要：為研究使用低值動物酶解蛋白替代部分魚粉對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）生長、體組成和抗氧化性能的影響，以初始體重為（0.05±0.01）g的凡納濱對蝦為研究對象，進行為期8周的養(yǎng)殖試驗，未替代魚粉組為對照組，用5%的魷魚肽、魚肽和雞肽分別替代飼料中的魚粉為替代組，配制4種等氮等脂飼料。結(jié)果表明：魷魚肽組和魚肽組與對照組相比特定生長率顯著提高，而雞肽組無顯著差異，與對照組相比僅魷魚肽組粗蛋白含量顯著增加，各替代組的粗脂肪含量均顯著升高。各替代組肝胰腺T-AOC活性均顯著上升。與對照組相比，魷魚肽組SOD、GSH-Px和CAT的活性均顯著上升，而魚肽和雞肽組均未顯著上升，各替代組血淋巴和肝胰腺中MDA含量均顯著下降，魷魚肽組上調(diào)了Nrf2基因表達(dá)和HO-1基因表達(dá)，下調(diào)了Keap1基因表達(dá)。綜上所述，魷魚肽和魚肽對凡納濱對蝦幼蝦的生長性能都有著顯著的促進作用，但在提高對蝦的營養(yǎng)水平，促進抗氧化基因的表達(dá)，減少抗氧化過程對機體內(nèi)細(xì)胞的損傷方面，魷魚肽效果更佳。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）；酶解蛋白；生長性能；抗氧化性能

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國對蝦主導(dǎo)養(yǎng)殖品種，養(yǎng)殖產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，2022年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到209.87萬t，比2021年增長了12.99%[1]。隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖規(guī)模的增加，對蝦飼料需求量增加，魚粉的需求量也隨之飆升。然而，魚粉受海洋捕撈量、極端天氣以及海洋環(huán)境等多方面因素的影響，出現(xiàn)了供求關(guān)系失衡的狀況。目前，尋求價格低廉、來源廣泛、以及對生態(tài)環(huán)境沒有負(fù)影響的魚粉替代蛋白源已成為當(dāng)務(wù)之急。

現(xiàn)階段，利用低值動物蛋白酶解后的產(chǎn)品替代魚粉成為解決魚粉短缺問題極具經(jīng)濟價值的方式。Zhou等[2]研究表明在低值飼料中添加3%的魷魚水解物增加了對蝦的攝食量，降低了魚粉使用量，節(jié)約了飼料成本，對生長性能未表現(xiàn)負(fù)面影響。低值蛋白經(jīng)過酶解后，蛋白質(zhì)以游離氨基酸、小肽和寡肽的形式存在，由于動物機體對小肽和寡肽的吸收效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氨基酸，因此酶解后的蛋白對生長具有促進作用。此外，酶解動物蛋白除了為水產(chǎn)動物提供營養(yǎng)外，還兼具其他功能特性，在黃顙魚、凡納濱對蝦、美洲黑石斑幼魚和大菱鲆幼魚等研究中表明，酶解蛋白能夠提高水產(chǎn)動物生長性能、抗氧化性能和誘食效果等[3-6]。Hlordzi[7]研究表明，水解魚蛋白粉替代魚粉對凡納濱對蝦的增重率、特定生長率和體組成等生長性能有積極影響。在水解魷魚內(nèi)臟投喂真鯛魚的研究表明，水解魷魚內(nèi)臟促進了真鯛魚的消化能力和攝食量，顯著提高真鯛魚的生長性能[8]。

目前，有關(guān)酶解動物蛋白對水產(chǎn)動物的生長性能和抗氧化性能影響的研究很多，但是飼料中魷魚肽、魚肽和雞肽分別替代部分魚粉對凡納濱對蝦幼蝦影響的對比研究未見報道。本研究針對當(dāng)前狀況，在飼料中添加三種不同酶解動物蛋白肽對凡納濱對蝦幼蝦生長、體組成以及抗氧化性能進行了研究，為酶解蛋白在凡納濱對蝦幼蝦飼料中的開發(fā)利用提供一定的實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗中使用的原料有魚粉、豆粕、面粉、血粉、魚油、豆油及添加劑，根據(jù)飼料配方（見表1）制作4組等氮等脂等能試驗飼料：在本研究中，以魚粉含量25%的基礎(chǔ)飼料為對照組，分別以5%酶解魷魚膏（魷魚肽組）、酶解鱈魚排（魚肽組）和酶解雞架（雞肽組）替代基礎(chǔ)飼料中的魚粉，制備3種飼料。原料粉碎過80目篩后按照配方混勻，用雙螺桿擠條機擠壓成粒徑1.0 mm的飼料，置于烘箱60 ℃熟化30 min后，自然風(fēng)干，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗養(yǎng)殖管理

將購買同一批次的蝦苗暫養(yǎng)7 d，然后選用大小均勻，體型健壯的蝦苗進行分組，每組設(shè)置3個平行，每個水箱120尾蝦苗，蝦苗的初始平均體重為（0.05±0.001）g，試驗用的水箱大小為0.12 m3，養(yǎng)殖試驗周期為56 d。養(yǎng)殖期間，每天投喂5次，日投喂量控制在蝦體重的6%～12%，每天換水2次，每次換水量為1/3。養(yǎng)殖期間不間斷供氧，水中溶解氧含量＞6.0 mg/L，海水鹽度為（30±1）‰，水溫保持在27～28 ℃，pH值為7.5～8.5，氨氮＜0.2 mg/L，亞硝酸鹽含量＜0.2 mg/L。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗56 d后，禁食24 h，測定全蝦生長性能指標(biāo)。每組隨機抽取10尾，其中5尾用于全蝦體成分分析，剩余5尾采集圍心腔血淋巴，離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min）取上清液；取血后置于冰盤上，解剖取出肝胰腺組織，保存于-80 ℃?zhèn)溆?，用于測定酶活指標(biāo)及總RNA的提取。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 常規(guī)成分及體成分測定指標(biāo) 水分測定用105 ℃烘干恒重法；粗蛋白含量用凱氏定氮法測定，粗脂肪用索氏抽提法測定，灰分用馬弗爐550 ℃灼燒至恒重。

1.4.2 肝胰腺和血淋巴抗氧化指標(biāo) 總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及丙二醛（MDA）的含量均采用南京建成生物科技有限公司的試劑盒測定，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 RNA分析和PCR熒光定量 提取肝胰腺組織的總RNA，并用生物分析儀和瓊脂電泳法檢測RNA完整性，用顯微分光光度計測定RNA純度和濃度，用熒光定量PCR檢測和定量RNA特定序列，引物序列見表2，運行g(shù)eNorm軟件作內(nèi)參優(yōu)選，選出EF1-α作為最優(yōu)內(nèi)參，并計算各組基因相對表達(dá)量。

1.4.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 260分析軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan′s均值多重比較法對試驗結(jié)果差異顯著性進行分析，差異顯著時（P<005），用GraphPad 8.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 酶解蛋白替代魚粉對凡納濱對蝦生長性能的影響

三種酶解蛋白替代魚粉對凡納濱對蝦幼蝦生長性能的影響見表3，魷魚肽組和魚肽組的終末體重（FBW）、增重率（WGR）和特定生長率（SGR）與對照組相比均顯著升高（P<0.05）；試驗各組間飼料系數(shù)（FCR）、蛋白質(zhì)效率（PER）、出肉率（MR）和肝體比（HBI）均無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 酶解蛋白替代魚粉對凡納濱對蝦體成分的影響

由表4可知，全蝦粗蛋白含量除魷魚組顯著高于對照組外（P＜0.05），其他各組均顯著降低（P＜0.05）；與對照組相比，替代組全蝦粗脂肪均顯著高于對照組（P＜0.05）；與其他組相比，僅雞肽組全蝦灰分含量顯著升高（P＜0.05）；全蝦水分含量各組間均無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 酶解蛋白替代魚粉對凡納濱對蝦幼蝦抗氧化及相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖1可知，3個替代組肝胰腺中T-AOC活性均顯著高于對照組，但魷魚肽組更明顯（P＜0.05），而在血淋巴中只有魷魚肽組T-AOC活性顯著高于對照組，其他替代組并沒有觀察到顯著差異（P＞0.05）。由圖2可知，在肝臟中，魷魚肽組的SOD和GSH-PX的活性與對照組相比均顯著升高（P＜0.05），而CAT的活性除魷魚肽組與對照組相比沒有顯著性差異外（P＞0.05），其他各組間CAT活性均顯著下降（P＜0.05），試驗各組間MDA含量與對照相比均顯著下降（P＜0.05）；在血淋巴中，與對照組相比，CAT的活性魷魚肽顯著上升（P＜0.05），雞肽組顯著下降（P＜0.05），而魚肽組沒有差異（P＞0.05）。所有試驗組血淋巴的MDA含量均表現(xiàn)出顯著下降（P＜0.05）。由圖3可知，魷魚肽組中Nrf2基因表達(dá)與對照組相比顯著上調(diào)，而其他試驗組中Nrf2基因表達(dá)顯著下降。在試驗各組中，Keap1基因表達(dá)均顯著下降（P＞0.05）。此外，Nrf2基因表達(dá)與Keap1基因表達(dá)的相對量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。魷魚肽組HO-1基因表達(dá)與對照組相比顯著上調(diào)（P＜0.05），其他各組間HO-1基因表達(dá)與對照組相比均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 三種酶解蛋白分別替代部分魚粉對凡納濱對蝦生長的影響

本研究生長結(jié)果表明，魷魚肽組和魚肽組凡納濱對蝦幼蝦的生長性能顯著提高，雞肽組與基礎(chǔ)組無顯著性差異。魷魚本身具有強烈的芳香魚腥味，添加到飼料中能夠起到誘食劑的作用，因此能夠提高生物的攝食率，增強其生長性能。已有研究表明，酶解魷魚內(nèi)臟粉或魷魚膏添加到飼料中，對提高凡納濱對蝦、中華鱉和真鯛魚的攝食性能和生長性能均有顯著影響[9-11]。呂斌等[3]的研究表明，酶解魷魚內(nèi)臟粉中含有的豐富游離氨基酸、小肽、?；撬嵋约捌渌麪I養(yǎng)因子，飼料中酶解魷魚內(nèi)臟粉替代3%的魚粉，可以顯著提高黃顙魚的攝食率，促進其生長性能的提升。酶解蛋白肽中的小肽或寡肽被轉(zhuǎn)運進入小腸黏膜的吸收細(xì)胞，在腸黏膜相應(yīng)的小肽載體作用下直接進入血液循環(huán)系統(tǒng)。由于小肽間的吸收是相互獨立，因此小肽或寡肽能夠快速地被生物機體吸收利用，促進生物機體的蛋白質(zhì)代謝，進而提高其生長性能。Hlordzi等[12]的研究表明，水解魚副產(chǎn)物中的小肽更易于被腸細(xì)胞吸收，當(dāng)替代4%的魚粉時，顯著提高了對蝦生長性能。在對克林雷式鲇（Rhamdia quelen）的研究中顯示，飼料中添加水解魚蛋白提高了其生長性能，魚蛋白水解物含有豐富的氨基酸和營養(yǎng)物質(zhì)，可以增加魚類的攝食率，并促進其生長和發(fā)育[13]。目前，也有研究表明，酶解雞漿或酶解家禽副產(chǎn)物對大口黑鱸和凡納濱對蝦的生長無促進作用[14-15]。Hlordzi[7]研究表明，酶解雞肉漿對凡納濱對蝦的生長性能沒有明顯影響。該結(jié)論與本研究中雞肽組對凡納濱對蝦幼蝦的生長性能無顯著影響基本一致。酶解蛋白肽中的小肽或寡肽能夠快速地被生物機體吸收利用，酶解物小肽的快速吸收特性能夠促進生物體的蛋白質(zhì)代謝，提高其生長性能。然而，還需要進一步的研究來探索小肽或寡肽的特性和作用機制。此外，從本研究結(jié)果看，魷魚肽組和魚肽組促生長效果要優(yōu)于雞肽組，這可能是三種酶解動物蛋白肽中的小肽分子量分布和游離氨基酸的含量差異，以及魷魚肽和魚肽所具有的誘食性能所致。因此下一步還需要對三種酶解動物蛋白肽中小肽、寡肽及氨基酸的分布情況進行更深入的研究和探討。

3.2 三種酶解蛋白分別替代部分魚粉對凡納濱對蝦體成分的影響

高質(zhì)量的蛋白源能夠提高生物機體消化吸收利用率，促進機體生長和組織更新[16]。本研究中魷魚肽組的全蝦粗蛋白含量顯著高于其他組。王寧等[17]研究表明，添加魷魚組，促進全蝦粗蛋白質(zhì)的合成，提高了凡納濱對蝦粗蛋白含量，效果優(yōu)于酶解魚漿和酶解蝦漿組，可能是魷魚組飼料中組胺含量更低，顯著提高了凡納濱對蝦腸道酶蛋白活性。魷魚肽中高蛋白源營養(yǎng)物質(zhì)，能夠更好地提高凡納濱對蝦幼蝦的消化吸收利用率，并增加其全蝦粗蛋白含量。本研究發(fā)現(xiàn)，雞肽組的全蝦粗蛋白含量與對照組相比顯著降低，而灰分含量則顯著升高。這表明凡納濱對蝦幼蝦對雞肽的吸收利用率較低，可能導(dǎo)致全蝦粗蛋白含量的下降。三種酶解蛋白中小肽或氨基酸營養(yǎng)成分含量存在差異，可能是導(dǎo)致吸收利用率不同的一個原因。然而，具體的機制仍需要進一步的研究來探索。

本研究中三個替代組全蝦粗脂肪含量均顯著高于對照組。肝體比通常可以作為肝臟脂肪或糖原蓄積的表觀指標(biāo)，但飼料中添加酶解蛋白均未對凡納濱對蝦幼蝦的肝體比造成顯著的影響，推測可能是對蝦體內(nèi)脂肪含量的增加并不足以引起脂肪在肝臟中沉積。呂斌等[18]研究表明，隨著飼料中酶解溶漿粉（魚、魷魚）添加水平的增加，黃顙魚的粗脂肪含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，添加過高水平的酶解溶漿粉，影響黃顙魚腸道對營養(yǎng)物的吸收利用率，因吸收的營養(yǎng)物質(zhì)不平衡導(dǎo)致生長發(fā)育受阻，增加了脂肪消耗的速率，魚體粗脂肪含量下降。王銨靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)2%～3%酶解蛋白能顯著降低凡納濱對蝦幼蝦肌肉粗脂肪含量。Li等[20]研究表明，添加小肽會顯著增加大口黑鱸肌肉粗蛋白與粗脂肪含量。根據(jù)本研究的生長性能以及肝體比等生長指標(biāo)分析，三種不同酶解肽能夠滿足其正常生長的營養(yǎng)需要，生長發(fā)育中脂肪累積速率大于脂肪消耗速率，因此，魷魚肽組的脂肪利用要優(yōu)于魚肽和雞肽組。

3.3 三種酶解蛋白分別替代部分魚粉對凡納濱對蝦抗氧化及相關(guān)基因表達(dá)的影響

總抗氧化能力（T-AOC）水平的高低反映了機體防御系統(tǒng)抗氧化能力的綜合性指標(biāo)[21]。Keap1-Nrf2介導(dǎo)氧化還原反應(yīng)體系，是生物機體內(nèi)源性抗氧化信號通路的重要組成部分[22]。Nrf2是一種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞保護的基因。Keap1負(fù)向調(diào)節(jié)Nrf2的功能，Keap1-Nrf2信號通路可激活調(diào)控機體內(nèi)一些抗氧化酶和蛋白質(zhì)的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，并參與炎癥、腫瘤、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬和病毒感染等過程[23]。當(dāng)生物機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，激活了Nrf2調(diào)控的下游靶基因包括SOD、GSH-Px、HO-1、CAT等基因的表達(dá)[24]。SOD、CAT和GSH-Px是酶促抗氧化防御系統(tǒng)的基本成分，它們共同參與機體氧化損傷的防御，其活性與生物機體免疫性能和外界環(huán)境脅迫有關(guān)[25]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是氧化損傷的重要標(biāo)志物。HO-1血紅素氧合酶1（Heme Oxygenase-1）是Nrf2主要依賴性基因，HO-1能夠抵御機體氧化應(yīng)激產(chǎn)生的過氧化物和超氧化物自由基對機體的損傷，在抗氧化防御和細(xì)胞凋亡預(yù)防中起重要作用[24]。本研究結(jié)果表明，魷魚肽的總抗氧化能力顯著上升，上調(diào)了凡納濱對蝦Nrf2基因表達(dá)，激活后的Nrf2調(diào)控下游靶基因SOD、GSH-Px、HO-1和CAT的表達(dá)顯著上升，下調(diào)Keap1基因表達(dá)，降低了MDA的含量，抑制了幼蝦機體細(xì)胞損傷，而魚肽和雞肽組雖然總抗氧化能力顯著上升，但是下調(diào)了Nrf2和Keap1基因表達(dá)。Jiang等[26]研究表明，魷魚肽中的小分子活性肽對自由基清除能力，以及增強抗氧化活性起著至關(guān)重要的作用，小分子活性肽可以作為生物食物中的抗氧化劑，具有抗氧化性、非特異性免疫和抗菌性。Suárez-Jiménez等[27]研究表明，水解魷魚副產(chǎn)物具有抗氧化、抗突變和抗增殖活性，水解后的魷魚副產(chǎn)物的抗氧化性增強是由于水解后產(chǎn)生的肽含有電子供體，這些電子供體更容易與自由基發(fā)生反應(yīng)，將它們轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。凡納濱對蝦的研究表明，當(dāng)飼料中添加5%的魷魚膏和1.5%的魚油時，可以增強肝胰腺中SOD的活性，清除凡納濱對蝦體內(nèi)過多的自由基，保護肝胰腺細(xì)胞免受毒害，同時也提高了CAT的活性，降低了MDA活性以及機體細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)帶來的損傷，增強機體吞噬細(xì)胞的防御能力，進而提高其抗病力，促進其健康生長[28]。本研究說明魷魚肽在調(diào)節(jié)Nrf2信號通路中的潛在作用機制，通過上調(diào)Nrf2基因的表達(dá)，調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)，降低Keap1基因的表達(dá)，魷魚肽有助于增強機體的抗氧化能力，減輕由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。然而，魚肽和雞肽組展示了對Nrf2和Keap1基因表達(dá)不同的調(diào)節(jié)效果?？赡苷f明魷魚肽中小肽物質(zhì)有助于防止凡納濱對蝦發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而降低了MDA的含量，減少對細(xì)胞的氧化毒性損傷。它們對于增強生物體的抗氧化能力的重要作用，特別是魷魚肽中的小分子活性肽在清除自由基、增強抗氧化活性等方面具有重要的功能，是一種有潛力的抗氧化劑。然而，需要進一步探究魷魚肽中小肽的特性和效果，以及其抗氧化方面的應(yīng)用潛力。

未來的研究可以探討不同酶解蛋白中的營養(yǎng)成分對Nrf2信號通路的調(diào)節(jié)作用以及調(diào)控下游抗氧化防御系統(tǒng)，更進一步探索細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化還原平衡調(diào)節(jié)的分子機制，為開發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖中新的酶解蛋白源提供理論支持。

4 結(jié)論

通過對凡納濱對蝦幼蝦生長、體組成、抗氧化能力以及相關(guān)基因表達(dá)的影響分析，研究結(jié)果表明魷魚肽組在促進凡納濱對蝦的生長、改善體組成、增強抗氧化能力以及調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)等方面表現(xiàn)出最佳效果。其次是魚肽，雖然其效果略遜于魷魚肽組，但仍然對凡納濱對蝦的生長和健康發(fā)育產(chǎn)生了積極影響，這為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飼料中添加魷魚肽、魚肽和雞肽等肽類飼料添加劑的使用提供重要參考數(shù)據(jù)。

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Effects of three enzymatic protein peptides replacing fishmeal on growth，body composition and antioxidant properties of juvenile Litopenaeus vannamei

BAO Qinghua， XIA Hui， YANG Yujie， HUANG Xiaorong

（College of Oceanography，Hebei Agricultural University，Qinhaungdao 066000，China）

Abstract：To understand the effects of replacing fish meal with low-value animal enzymatic protein on the growth， body composition， and antioxidant performance of Litopenaeus vannamei， L.vannamei were used as the research subjects with the initial weight of 0.05 ± 0.01 g for 8 weeks. The group which fish meal was not replaced served as the control group. The fish meal was replaced respectively with 5% of the squid peptide， fish peptide and chicken peptide in the replacement groups. Four types of equi-protein and equi-fat feeds were formulated.The results showed as follows： special growth rate of the the squid peptide group and the fish peptide group were significantly higher than the control group. the crude protein content of the squid peptide group was significantly higher than the control group in the body composition， the crude fat content was significantly higher in all substitution groups than the control group. The hepatic and pancreatic T-AOC activities significantly increased in all three enzymatic peptide groups compared to the control group. The activities of SOD， GSH-Px and CAT increased significantly in the squid peptide compared to the control group， while no significant difference were observed in fish peptide and chicken peptide groups， the content of MDA in all substitution sroups decreased significantly in hemolymph and hepatopancreas. The Nrf2 gene and HO-1 gene expression were up-regulated significantly， and the Keap1 gene expression was down-regulated significantly in squid peptide group. In conclusion， the growth performance of L.vannamei was significantly promoted in the squid peptide group and fish peptide group， but the squid peptide was better than the other groups，in improving the nutritional level of shrimp， promoting the antioxidant genes expression and reducing the damage to cells in the body during antioxidant process.

Key words：Litopenaeus vannamei; enzymatic hydrolysis protein; growth performance; antioxidant properties