高維亞，趙春海，竇守席

（1.濱州市檢驗(yàn)檢測中心，山東濱州 256600； 2.濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濱州 256600）

拉曼光譜分析技術(shù)是在20 世紀(jì)20 年代逐步發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，是基于印度物理學(xué)家拉曼所發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應(yīng)，對與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析，得到分子振動或轉(zhuǎn)動方面信息，并應(yīng)用于物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。拉曼光譜作為一種可以對物質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行“指紋”識別的光譜技術(shù)，具有無損、信息豐富、無需樣品制備等優(yōu)點(diǎn)，使得拉曼光譜成為探測樣品信息的有力工具。目前，拉曼光譜技術(shù)已發(fā)展成為一項(xiàng)非常成熟的技術(shù)，已成為分析檢測領(lǐng)域[1-5]中的重要分析手段之一。傳統(tǒng)的檢測手段多集中在色譜法和色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，由于存在樣品預(yù)處理步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)耗力等缺點(diǎn)，在快速測定和實(shí)時(shí)監(jiān)測方面存在一定局限性。拉曼光譜技術(shù)因其自身操作簡便，以及高靈敏度等特點(diǎn)，近年來已成為生物[6-8]、制藥[9-10]、材料[11-12]、地質(zhì)[13-14]、環(huán)境監(jiān)測[15]、半導(dǎo)體[16]、反恐[17]和珠寶鑒定[18-19]等眾多分析領(lǐng)域的重要研究方法。顯微共焦拉曼光譜技術(shù)是將拉曼光譜技術(shù)和顯微分析技術(shù)結(jié)合起來的一種應(yīng)用技術(shù)，顯微共焦拉曼光譜儀將拉曼光譜儀和光學(xué)顯微鏡耦合在一起，通過不同倍數(shù)物鏡觀察樣品的形貌特征，并通過共焦針孔實(shí)現(xiàn)空間濾波功能，將激光光斑聚焦在樣品上進(jìn)行拉曼測量。聚焦良好的激光束能夠給出很小的激光斑點(diǎn)，從而獲得較高的橫向空間分辨率，同時(shí)激光束的快速發(fā)散還能夠獲得較高的軸向(深度)分辨率[20]，因此顯微共焦拉曼光譜技術(shù)具有高靈敏度和高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，是目前最適合用于物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)檢測的拉曼光譜技術(shù)。

InVia Reflex 顯微共焦拉曼光譜儀是英國雷尼紹(Renishaw)公司生產(chǎn)的由一臺研究級顯微鏡和一臺高性能拉曼光譜儀耦合而成的具有快速、高靈敏度、高空間分辨率和高度自動化的拉曼光譜分析儀器，是研究級顯微拉曼光譜儀。該儀器具備以下特點(diǎn)：(1)高度自動化，易于操作和維護(hù)，全自動化功能可實(shí)現(xiàn)操縱激光波長、濾光片和光柵的變化；(2)性能出眾，實(shí)現(xiàn)高信號傳輸效率與高光譜分辨率和穩(wěn)定性相結(jié)合；(3)高靈活性和可升級性，可配用附件、激光器、光纖探頭或?qū)⒗c其它技術(shù)(SEM、AFM、TEM 等)聯(lián)用；(4)功能強(qiáng)大，進(jìn)行拉曼和光致發(fā)光兩種測量，以獲取材料在電子和振動結(jié)構(gòu)方面的信息，可生成高質(zhì)量、細(xì)節(jié)豐富的拉曼成像。

筆者以InVia Reflex顯微共焦拉曼光譜儀為例，結(jié)合筆者的使用及管理經(jīng)驗(yàn)，對其工作原理、使用方法、管理與維護(hù)進(jìn)行了總結(jié)，并著重對儀器使用過程中的常見問題與解決方案進(jìn)行了分析，以期為拉曼光譜研究及相關(guān)工作提供幫助。

1 工作原理

InVia Reflex 顯微共焦拉曼光譜儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1所示，主要由激光器、激光光路、信號光路、光探測器、數(shù)據(jù)讀取系統(tǒng)及電腦控制系統(tǒng)組成。該儀器工作原理是基于拉曼散射的產(chǎn)生和分析，通過激光光束的聚焦、拉曼散射的產(chǎn)生、光譜分析和顯微觀察等步驟實(shí)現(xiàn)對樣品的分析。在拉曼光譜檢測中，散射光的頻率和強(qiáng)度與樣品的分子結(jié)構(gòu)、組成和性質(zhì)有關(guān)，不同化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物分子的拉曼位移不同，被稱為化合物分子指紋光譜。通過對拉曼光譜的峰位、峰形、強(qiáng)度等參數(shù)進(jìn)行分析，可以獲得樣品的化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)等信息，也可對降解、聚合物反應(yīng)等過程進(jìn)行原位監(jiān)測。通過精密控制光學(xué)平臺按一定步長進(jìn)行移動，對樣品進(jìn)行全面快速掃描，利用光譜數(shù)據(jù)分析軟件對采集到的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到高分辨率的拉曼成像。

圖1 InVia Reflex顯微共焦拉曼光譜儀系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig.1 System structure of InVia Reflex microscopic confocal Raman spectrometer

2 儀器的使用方法及樣品處理

2.1 開關(guān)機(jī)與校準(zhǔn)

InVia Reflex 顯微共焦拉曼光譜儀的測試過程一般包括開機(jī)、校準(zhǔn)、放置樣品、聚焦樣品、設(shè)置檢測參數(shù)、光譜采集、數(shù)據(jù)保存。

顯微共焦拉曼光譜儀的校準(zhǔn)關(guān)系到樣品測試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。儀器狀態(tài)會受到環(huán)境溫度和濕度、激光器和光柵的切換等因素影響，使儀器的靈敏度和準(zhǔn)確度出現(xiàn)偏差，因此有必要在測試前對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。校準(zhǔn)方式主要有兩種：內(nèi)置硅片校準(zhǔn)和外置硅片校準(zhǔn)。InVia Reflex 顯微共焦拉曼光譜儀自帶內(nèi)置硅片校準(zhǔn)，可在儀器開機(jī)后，通過操作WIRE軟件，系統(tǒng)將自動切換至內(nèi)置硅片進(jìn)行自動峰位校正。

圖2 為使用儀器內(nèi)置單晶硅校準(zhǔn)后的結(jié)果，室溫條件下單晶硅的峰位于520.7 cm-1處。

圖2 單晶硅的一階拉曼光譜圖Fig.2 First order Raman spectrogram of monocrystalline silicon

2.2 樣品預(yù)處理

拉曼光譜可以用來分析固體、粉末、液體、氣體、膠體、軟膏等多種不同類型的樣品，所測樣品須為具有共價(jià)鍵或分子間作用力的物質(zhì)，并非所有的分子結(jié)構(gòu)都有拉曼活性。檢測拉曼光譜時(shí)一般不需要制備樣品，特別是帶有顯微鏡的激光拉曼光譜儀。

(1) 固體樣品。通常的塊狀固體材料樣品，不管其體積和大小如何，只要將樣品固定在拉曼光譜儀的樣品臺上進(jìn)行測試即可。如果樣品體積較大，需要使用光纖探針，直接在原位置對樣品進(jìn)行測試，應(yīng)盡量選擇表面平整的區(qū)域。對于粉末樣品，測試前應(yīng)先用載玻片將粉末樣品壓平，以獲得平整表面。進(jìn)行拉曼成像時(shí)，要求成像區(qū)域水平且平整，不平整的樣品可以借助美工刀刮平。

(2) 液體樣品。對于不易揮發(fā)的液體樣品，可將其倒入一個(gè)小的培養(yǎng)皿中，或者用滴管吸取適量滴在載玻片上，然后放置在拉曼光譜儀的樣品臺上進(jìn)行檢測。對于易揮發(fā)或具有腐蝕性的液體樣品，可先將其倒入一個(gè)無色透明的玻璃瓶中，蓋好瓶蓋，或者將其封閉在細(xì)毛細(xì)管中，然后放置在拉曼光譜儀的樣品臺上進(jìn)行檢測。激光被直接聚焦在樣品上或者透過容器壁聚焦于樣品上。

(3) 氣體樣品。氣體樣品一般置于密封的玻璃管或者細(xì)毛細(xì)管中，氣體樣品的拉曼散射強(qiáng)度通常較弱，一般在測試前需對其進(jìn)行壓縮處理，以增大氣體密度，測試時(shí)選用大功率激光器，增大激光功率，獲得高質(zhì)量拉曼光譜。

3 儀器的管理與維護(hù)

3.1 儀器維護(hù)

顯微共焦拉曼光譜儀是一種精密儀器，需要定期進(jìn)行清潔維護(hù)保養(yǎng)，以確保儀器正常運(yùn)行和精準(zhǔn)度，提高儀器的使用效率并降低故障率。顯微共焦拉曼光譜儀的維護(hù)工作需由專人負(fù)責(zé)，主要內(nèi)容包括工作環(huán)境的維護(hù)和儀器設(shè)備本身的維護(hù)，即(1)定期清潔儀器外殼和顯微鏡鏡頭；(2)在不使用時(shí)，需存放在室溫、干燥、無塵的環(huán)境中，因?yàn)闇囟冗^高或過低、濕度過重、灰塵積累都可能會影響光譜儀的使用精度；(3)定期檢查儀器各個(gè)部件，如激光器、CCD探測器等是否正常工作，如果發(fā)現(xiàn)問題需要及時(shí)修理或更換；(4)避免在同一天多次開關(guān)機(jī)，盡量保持開機(jī)狀態(tài)，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后關(guān)機(jī)，以提高激光器的有效使用壽命。定期對儀器進(jìn)行維護(hù)可以有效預(yù)防事故的發(fā)生，延長儀器的使用壽命。

3.2 管理人員的培訓(xùn)

大型儀器設(shè)備的高效運(yùn)行，是提高科技創(chuàng)新能力的重要支撐，是高校、科研及檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)。保證儀器設(shè)備的有效運(yùn)行，可以提高儀器設(shè)備的使用效益、科研效益和經(jīng)濟(jì)效益。InVia Reflex 顯微共焦拉曼光譜儀屬于大型分析儀器，儀器比較昂貴，應(yīng)實(shí)行專人管理負(fù)責(zé)制。儀器管理員負(fù)責(zé)設(shè)備的操作和日常維護(hù)。儀器管理員在使用設(shè)備之前應(yīng)接受儀器公司的工程師培訓(xùn)，學(xué)習(xí)儀器的使用方法、流程、注意事項(xiàng)及維護(hù)方法。儀器管理人員應(yīng)定期檢查設(shè)備的運(yùn)行情況，做好維護(hù)管理工作，保證儀器正常有序運(yùn)行。

4 測試過程常見問題及解決方案

4.1 激光器使用的安全問題

在設(shè)備使用過程中，需要特別注意的是激光器使用時(shí)的安全問題。高功率激光會對人體組織產(chǎn)生嚴(yán)重傷害。InVia Reflex 顯微共焦拉曼光譜儀安全防護(hù)分為三級：Class 1，Class 3B和Class 4。若設(shè)備配有顯微鏡遮光罩，安全級別將達(dá)到最高級Class 1，無須擔(dān)心激光輻射。若無任何保護(hù)，會存在潛在激光暴露危險(xiǎn)，建議使用多套安全眼鏡或護(hù)目鏡，避免激光對眼睛的直接傷害。

4.2 選擇激光器

拉曼光譜分析系統(tǒng)最早使用的光源是太陽光和汞燈。激光器出現(xiàn)后，因其具有亮度極高、方向性強(qiáng)、單色性和相干性能好、幾乎是線偏振、傳輸距離長等優(yōu)點(diǎn)，迅速成為最常用的激發(fā)光源，對拉曼光譜技術(shù)的快速發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。在日常檢測中，可通過選擇不同波長的激光器避免樣品被燒壞，獲得高質(zhì)量的拉曼光譜信號。不同波長激光器的應(yīng)用領(lǐng)域及優(yōu)缺點(diǎn)見表1[20]。

表1 不同波長激光器的應(yīng)用領(lǐng)域及優(yōu)缺點(diǎn)Tab.1 Application fields and advantages and disadvantages of lasers with different wavelengths

4.3 光譜中的假峰

假峰主要有以下幾種形式：宇宙射線、光源發(fā)射線(等離子線等)、外界干擾光源發(fā)射線(顯示器屏幕、室內(nèi)熒光燈等)和常見氣體來源(N2、O2)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的白光照明燈可能會發(fā)射一定波長的譜線，在拉曼測試過程中被檢測到，在相同位置重復(fù)出現(xiàn)，尤其在使用長焦物鏡時(shí)更明顯，此時(shí)可以考慮關(guān)閉照明燈，在暗室測試。如果儀器配備顯微鏡遮光罩，則照明燈影響較小。

宇宙射線的產(chǎn)生是宇宙中的高能粒子轟擊CCD 探測器而產(chǎn)生電子，被CCD 檢測為信號所致。宇宙射線一般具有兩個(gè)特點(diǎn)，一是隨機(jī)產(chǎn)生，位置不固定，可用重復(fù)測試的方法判斷是否為宇宙射線，若消失或出現(xiàn)在其它位置則為宇宙射線；二是強(qiáng)度高，峰寬較窄，僅占幾個(gè)波數(shù)。圖3 中框出的峰為宇宙射線。當(dāng)出現(xiàn)宇宙射線時(shí)，可以使用配套軟件中的去宇宙射線功能將其去除。

圖3 宇宙射線拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectrogram of cosmic ray

4.4 激光損壞樣品

在進(jìn)行樣品測試時(shí)，激光照射在樣品表面的能量較大，尤其是一些對熱或光十分敏感的樣品，非常容易被激光灼燒，導(dǎo)致測量信號包含樣品被燒毀后的特征，而不是樣品本征的信號(例如非晶碳膜在1500 cm-1附近的本征峰在強(qiáng)光激發(fā)時(shí)會顯示出石墨化的碳峰)，因此必須足夠重視激光對樣品可能引起的損傷。當(dāng)遇到樣品被激光損壞時(shí)，可在測試前后通過顯微鏡白光像，觀察樣品表面是否發(fā)生明顯變化，觀察出峰位置及峰形是否發(fā)生變化，然后選擇合適的激光功率來進(jìn)行測試。

為避免樣品表面燒毀，在開始測試時(shí)應(yīng)選用較低的激發(fā)功率。在保證樣品不被燒毀的前提下可提高激發(fā)功率以得到比較強(qiáng)的信號。當(dāng)激光功率衰減到1%仍無法避免樣品燒毀時(shí)，可考慮更換激發(fā)光、轉(zhuǎn)換低倍物鏡或者以散焦方式照射樣品，以降低照射在樣品表面的功率密度。圖4為樣品被激光灼燒后的白光圖[21]。

圖4 激光損壞樣品白光圖Fig.4 White light image of laser damaged sample

4.5 熒光背景過強(qiáng)

熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，普遍存在于拉曼光譜采集過程中，拉曼光和熒光都是在激光激發(fā)下產(chǎn)生的，可有效消除熒光干擾，獲得準(zhǔn)確、可靠的拉曼譜圖，是進(jìn)行拉曼光譜采集的關(guān)鍵。部分物質(zhì)的拉曼光譜熒光背景較強(qiáng)，可通過適當(dāng)方式抑制或消除熒光干擾。圖5為典型的熒光背景較強(qiáng)的拉曼譜圖［21］。

圖5 熒光背景較強(qiáng)的拉曼光譜圖Fig.5 Raman spectrogram with strong fluorescence background

4.5.1 內(nèi)源性方法

內(nèi)源性方法通過以下兩種途徑抑制或消除熒光干擾：(1)降低樣品溫度，如利用液氮、液氦降低溫度；(2)加入熒光猝滅劑浸泡，如加入硝基苯、KBr，AgI等。該方法常在生物類樣品測試中采用。

4.5.2 外源性方法

外源性方法通過以下幾種途徑抑制或消除熒光干擾：(1)熒光具有固定的波長范圍，可以通過切換不同波長的激光，避開背景熒光干擾；(2)改變激光功率，使拉曼信號和熒光信號的相對強(qiáng)度改變；(3)選擇高共聚焦模式，減小樣品測試體積元，以減少樣品襯底材料熒光對表面材料的干擾；(4)通過強(qiáng)激光長時(shí)間照射漂白，持續(xù)照射樣品1 min以上，利用物質(zhì)的“熒光漂白效應(yīng)”消除熒光干擾。例如，通過測試發(fā)現(xiàn)，蠶絲是一種典型的具有“熒光漂白效應(yīng)”的物質(zhì)，圖6 為蠶絲樣品經(jīng)激光照射不同時(shí)間后的拉曼光譜變化。由圖6 可以看出，隨著激光照射時(shí)間增加，熒光效應(yīng)得到了有效抑制。王國禎等也發(fā)表了類似研究結(jié)果[22]。

圖6 激光照射不同時(shí)間后蠶絲樣品的拉曼光譜圖（黑色：激光照射10 s；紅色：激光照射20 s；綠色：激光照射30 s；藍(lán)色：激光照射40 s）Fig.6 Raman spectrogram of silk samples after laser irradiation for different times（Black： Laser irradiation for 10 seconds； Red： Laser irradiation for 20 seconds； Green： Laser irradiation for 30 seconds；Blue： Laser irradiation for 40 seconds）

4.6 光譜信噪比差

信噪比(SNR，Signal to Noise Ratio)，是指接收到的有用信號的強(qiáng)度與接收到的干擾信號(噪聲和干擾)的強(qiáng)度的比值。在拉曼光譜實(shí)驗(yàn)中，得到一張信噪比高、高質(zhì)量的拉曼光譜圖非常關(guān)鍵。提高信噪比可以減少噪聲對信號的干擾，從而提高信號的質(zhì)量和可靠性，高質(zhì)量的拉曼譜圖能夠體現(xiàn)出精細(xì)的信息?？梢酝ㄟ^以下幾種方式增加信噪比：(1)增加激光功率；(2)增加曝光時(shí)間；(3)增加累積次數(shù)；(4)更換高倍物鏡。

4.7 光譜信號過強(qiáng)

采集拉曼光譜時(shí)，有時(shí)會得到光譜信號過強(qiáng)的譜圖，即飽和拉曼光譜圖，如圖7所示。這是因?yàn)榧す夤β蔬^大造成的拉曼響應(yīng)過大，譜線變成虛點(diǎn)形狀，譜線的飽和溢出部分被拉到0。當(dāng)遇到光譜信號過強(qiáng)時(shí)，將激光功率調(diào)低、減小曝光時(shí)間即可。

圖7 飽和拉曼光譜圖Fig.7 Saturated Raman spectrogram

4.8 拉曼光譜圖因樣品位置取向不同而不同

拉曼光譜圖因樣品位置取向不同而不同是由入射激光照射在樣品表面不同晶面取向上引起的，可采用四分之一波片對激光進(jìn)行擾偏去除方向效應(yīng)。

4.9 金屬拉曼光譜

有研究報(bào)道，密排六方晶格結(jié)構(gòu)(HCP)金屬(如Be、Re、Os等)在特殊條件下存在拉曼活性。常見的金屬(如Fe、Cu、Au 等)在常溫常壓下大多為體心立方或面心立方結(jié)構(gòu)，沒有拉曼活性模，不會產(chǎn)生拉曼光譜信號。然而，在HCP 金屬的晶格中，一個(gè)原胞單元由兩個(gè)原子組成，具有拉曼活性[23]。金屬的拉曼光譜可以提供關(guān)于金屬表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)、振動模式以及電子結(jié)構(gòu)等信息，這些信息對于了解金屬的物理和化學(xué)性質(zhì)以及在高壓等極端條件下的行為具有重要的意義。1992 年，Olijnyk[24]首次測得高壓下金屬Ge在50 GPa的拉曼光譜。Novoselov等[25]用拉曼光譜研究了鉿在室溫下0～67 GPa壓力區(qū)光譜的演變。劉靜儀等[26]測量了金屬元素鋨(Os)、錸(Re)的高壓拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)Os在高壓下存在電子拓?fù)滠S遷的光譜學(xué)證據(jù)。

5 結(jié)語

顯微共焦拉曼光譜儀作為一種重要的分析儀器，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研發(fā)、產(chǎn)品質(zhì)量檢測等領(lǐng)域。目前國內(nèi)在拉曼光譜研究領(lǐng)域發(fā)展良好，部分團(tuán)隊(duì)研究水平及成果已位于世界領(lǐng)先地位。了解顯微共焦拉曼光譜儀的工作原理、使用方法、管理與維護(hù)、常見問題及解決方案，對于提高儀器的使用及管理水平，進(jìn)一步促進(jìn)拉曼技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。