王洪妮，張麗麗，俞斌，陳海華

（江蘇全威檢測(cè)有限公司，江蘇常州 213164）

咪鮮胺作為一種低毒殺菌劑，被廣泛用于防治蔬菜瓜果的炭疽病、葉斑病、枯萎病等[1-2]。目前市售的咪鮮胺原藥大多是以2，4，6-三氯苯酚為原料，依次與1，2-二氯乙烷、丙胺、光氣、咪唑等反應(yīng)制得[3-4]。該合成路線中會(huì)伴隨以含氯化合物作為前驅(qū)體經(jīng)縮合反應(yīng)生成的二噁英類副產(chǎn)物[5-6]，二噁英類化合物會(huì)通過咪鮮胺原藥的生產(chǎn)和使用擴(kuò)散到生態(tài)環(huán)境中，造成一定程度的污染。二噁英類化合物屬于持久性有機(jī)污染物，被國際研究中心列為一級(jí)致癌物，具有不可逆的致癌、致畸、致突變毒性，其與呼吸毒性、皮膚毒性、肝毒性、生殖毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性和內(nèi)分泌毒性等多種毒性作用[7-8]，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生較大危害，因此檢測(cè)咪鮮胺原藥中二噁英類化合物，對(duì)于加強(qiáng)持久性有機(jī)污染物防治，保護(hù)人類家園具有重要意義。

二噁英類化合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法、酶誘導(dǎo)法、體外熒光素酶法、酶聯(lián)免疫分析法等[9-12]，其中高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法是國際上公認(rèn)的最權(quán)威的二噁英類化合物檢測(cè)方法，能精確地檢測(cè)出二噁英類化合物的種類，并準(zhǔn)確定量，是我國市場(chǎng)上出具檢測(cè)報(bào)告的唯一方法[13]。目前我國二噁英檢測(cè)主要集中在環(huán)境、食品領(lǐng)域，尚未有咪鮮胺原藥中二噁英類污染物檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道?？紤]到咪鮮胺農(nóng)藥應(yīng)用的廣泛性，以及二噁英類化合物超痕量檢測(cè)的復(fù)雜性，筆者建立了一種同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定咪鮮胺原藥中17 種二噁英類化合物。該方法實(shí)用性強(qiáng)，靈敏度高，特異性好，可為包括咪鮮胺原藥在內(nèi)的含氯有機(jī)農(nóng)藥中二噁英類化合物的檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜聯(lián)用儀：Thermo Trace 1310-DFS 型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

電子分析天平：YP10002 型，感量為0.01 g，上海越平科學(xué)儀器有限公司。

強(qiáng)磁力攪拌器：98-2 型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：YRE-201D型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

全自動(dòng)氮空吹掃儀：YGC-16A 型，天津艾維歐科技發(fā)展有限公司。

微量注射器：10 μL-N 型，哈美頓(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ：包含15 種同位素13C12標(biāo)記的二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質(zhì)量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司。

表1 二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液信息Tab.1 Information of dioxin mixed standard solution

二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ：包含2 種同位素13C12標(biāo)記的二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質(zhì)量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司。

二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅲ：包含17種二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質(zhì)量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司。

二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅳ：包含17種二噁英類化合物，由二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅲ稀釋制得，溶劑為壬烷，各組分質(zhì)量濃度見表1。

二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液CS1～CS5：包含17 種二噁英類化合物和17 種同位素13C12標(biāo)記的二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質(zhì)量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標(biāo)準(zhǔn)品)公司。

正己烷：農(nóng)殘級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

甲苯：農(nóng)殘級(jí)，麥吉睿珀(上海)生物科技有限公司。

二氯甲烷：農(nóng)殘級(jí)，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

中性硅膠：60N型，日本關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社。

活性炭硅膠：二噁英類化合物分析專用，日本關(guān)東化學(xué)株式會(huì)社。

無水硫酸鈉：優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

咪鮮胺原藥樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 氣相色譜儀

色譜柱：TR-Dioxin-5MS 型毛細(xì)管柱[60 m×0.25 mm，0.25 μm，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣：高純氦氣；載氣流量：1 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 μL；升溫程序：初始溫度為140 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持16 min，以5 ℃/min 的速率升溫至235 ℃，保持7 min，以5 ℃/min 的速率升溫至310 ℃，保持10 min。

1.2.2 高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜儀

離子源：電子轟擊(EI)；檢測(cè)方式：選擇離子監(jiān)測(cè)(MID)；離子源溫度：260 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電子能量：45 eV；分辨率：大于10 000。

1.3 相對(duì)響應(yīng)因子計(jì)算

分別取二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液CS1～CS5，按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，由工作站軟件Target Quan分析數(shù)據(jù)，參考GB 5009.205—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二噁英及其類似物毒性當(dāng)量的測(cè)定》計(jì)算相對(duì)響應(yīng)因子及其平均值，該相對(duì)響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于20%，否則需重新試驗(yàn)并計(jì)算。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品提取

稱取10.00 g (精確至0.01 g)咪鮮胺原藥樣品于燒杯中，加入200 mL正己烷-二氯甲烷(體積比為5∶1)混合溶劑溶解，樣品全部溶解后用微量注射器加入5 μL二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅰ，再加入30 g酸化硅膠(由44 g 濃硫酸和56 g 中性硅膠配制而成，下同)，磁力攪拌2 h，用無水硫酸鈉小柱過濾；燒杯中剩余的酸化硅膠加入50 mL 正己烷清洗，磁力攪拌30 min，用無水硫酸鈉小柱過濾；重復(fù)清洗3 次，收集全部過濾液作為樣品提取液，濃縮至2 mL左右待下一步凈化。若酸化硅膠的顏色較深，則重復(fù)酸化硅膠提取過程，直至酸化硅膠為淺黃色。

1.4.2 樣品凈化

選用多層硅膠柱與活性炭硅膠柱組合方式凈化。多層硅膠柱填料從下到上依次為4 g無水硫酸鈉、3 g中性硅膠、5 g堿性硅膠(由40 mL質(zhì)量濃度為50 g/L氫氧化鈉溶液和98 g中性硅膠配制而成)、2 g中性硅膠、10 g 酸化硅膠、2 g 中性硅膠、4 g 無水硫酸鈉。用40 mL 正己烷淋洗活化柱子后上樣，用120 mL 正己烷淋洗多層硅膠柱，接收洗出液，濃縮后待活性炭硅膠柱凈化。

活性炭硅膠柱填料為1 g活性炭硅膠，用40 mL正己烷清洗活化柱子后上樣，依次用25 mL正己烷、40 mL正己烷-二氯甲烷(體積比為3∶1)混合溶劑淋洗柱子，棄去洗出液，翻轉(zhuǎn)活性炭硅膠柱，用60 mL甲苯淋洗翻轉(zhuǎn)后的活性炭硅膠柱，接收該甲苯洗出液，濃縮后用二氯甲烷定量轉(zhuǎn)移至2 mL全回收自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，用高純氮?dú)獯党嘤嗳軇?，濃縮至近干后，加入5 μL 二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅱ和20 μL 壬烷，作為樣品溶液。

1.4.3 樣品測(cè)定

凈化后的樣品溶液按照1.2儀器工作條件測(cè)定，根據(jù)1.3計(jì)算的相對(duì)響應(yīng)因子平均值，由工作站軟件TargetQuan 分析數(shù)據(jù)，參考HJ 77.3—2008《固體廢物 二噁英類的測(cè)定 同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法》，以同位素稀釋二級(jí)內(nèi)標(biāo)法定量計(jì)算17種2，3，7，8-氯代二噁英類化合物質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法選擇和優(yōu)化

二噁英類化合物常用的提取方法有索氏提取法、加速溶劑法、液液萃取法、酸化硅膠吸附法等[14]。咪鮮胺原藥熔點(diǎn)(46.5～49.3 ℃)較低，不適宜采用索氏提取和加速溶劑提取方式提取；咪鮮胺原藥微溶于水(25 ℃時(shí)在水中溶解度為34.4 mg/L)，也不適宜采用液液萃取方式提取。酸化硅膠可吸附多種離子或非離子性官能團(tuán)化合物，如生物堿、糖脂、多環(huán)芳香族化合物及胺類物質(zhì)等，且吸附容量大，不易造成過載，可有效吸附咪鮮胺化合物而不吸附二噁英類物質(zhì)，從而達(dá)到分離提取二噁英類化合物的目的，方便快捷，成本低，故選擇酸化硅膠吸附法提取樣品。

2.2 提取溶劑選擇

分別選擇乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷及正己烷-二氯甲烷混合溶劑作為提取溶劑，考察不同溶劑溶解咪鮮胺原藥后酸化硅膠的吸附效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷-二氯甲烷混合溶劑提取效果最好，樣品經(jīng)乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷單一溶劑溶解后，酸化硅膠無法完全吸附咪鮮胺，上清液濃縮后會(huì)出現(xiàn)咪鮮胺化合物殘留。進(jìn)一步考察不同體積比的正己烷-二氯甲烷混合溶劑對(duì)酸化硅膠吸附效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正己烷與二氯甲烷的體積比為1∶1時(shí)，酸化硅膠無法完全吸附去除咪鮮胺，上清液濃縮后有咪鮮胺化合物殘留；而當(dāng)正己烷與二氯甲烷的體積比為10∶1時(shí)，無法完全溶解咪鮮胺原藥。調(diào)整正己烷與二氯甲烷的體積比，同時(shí)綜合考慮混合溶劑的毒性，在保證樣品提取效果的基礎(chǔ)上盡量減少二氯甲烷用量。結(jié)果表明，當(dāng)正己烷與二氯甲烷的體積比為5∶1 時(shí)能完全溶解咪鮮胺原藥，酸化硅膠可吸附全部咪鮮胺，上清液濃縮后沒有咪鮮胺化合物殘留，提取效果最好，故選擇正己烷-二氯甲烷混合溶劑的體積比為5∶1。

2.3 色譜條件優(yōu)化

選擇賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)的二噁英類化合物檢測(cè)專用TR-Dioxin-5MS 型毛細(xì)管柱，固定相為5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，柱長60 m。色譜條件參考HJ 77.3—2008 設(shè)定，升溫程序、進(jìn)樣方式未作改變，進(jìn)樣口溫度略有調(diào)整，結(jié)合GB 5009.205—2013，將進(jìn)樣口溫度升高10 ℃，調(diào)整為280 ℃，確保樣品氣化完全，降低高氯代二噁英類化合物的損失，優(yōu)化結(jié)果見1.2.1。

在優(yōu)化的色譜條件下分別測(cè)定咪鮮胺原藥和二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(CS3)，總離子流色譜圖如圖1所示。圖1結(jié)果表明，該色譜柱抗干擾能力強(qiáng)，在高分辨率條件下，可實(shí)現(xiàn)17種二噁英類化合物的良好分離，樣品基質(zhì)不產(chǎn)生干擾。

圖1 咪鮮胺原藥和二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（CS3）總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of prochloraz and dioxin mixed standard solution（CS3）

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件參考HJ 77.3—2008設(shè)定，并按該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分辨率調(diào)節(jié)和質(zhì)量校正，優(yōu)化結(jié)果見1.2.2。

2.5 線性方程與方法檢出限

在1.2儀器工作條件下，分別測(cè)定二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液CS1～CS5，以二噁英類化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以二噁英類化合物兩個(gè)監(jiān)測(cè)離子色譜峰面積之和與對(duì)應(yīng)的同位素13C12標(biāo)記的二噁英類化合物兩個(gè)監(jiān)測(cè)離子峰面積之和的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

以正己烷-二氯甲烷混合溶劑(體積比為5∶1)為空白試劑，添加5 μL 二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅳ，按1.4 實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)測(cè)定7 次，計(jì)算測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法檢出限[15]，根據(jù)稱樣質(zhì)量換算成樣品中的含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。

17種二噁英類化合物的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。由表2 可知，17種二噁英類化合物的質(zhì)量濃度在對(duì)應(yīng)范圍內(nèi)與色譜峰面積比值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 7～0.999 9。當(dāng)稱樣量為10 g 時(shí)，咪鮮胺原藥樣品中二噁英類化合物的檢出限為0.01～0.1 ng/kg，表明該方法靈敏度高，滿足分析要求。

表2 17種二噁英類化合物質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.2 Linear range，linear equation，correlation coefficient and detection limit of 17 dioxins

2.6 精密度試驗(yàn)

取同一批次咪鮮胺原藥樣品6份，按1.4實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。由表3 可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～13.6%，表明該方法精密度較高，滿足分析要求。此外，咪鮮胺原藥中二噁英類化合物測(cè)定結(jié)果呈現(xiàn)多氯代二苯并-對(duì)-二噁英比多氯代二苯并呋喃含量高的趨勢(shì)，二噁英類化合物分布規(guī)律基本符合二噁英類化合物合成機(jī)理，即前驅(qū)物反應(yīng)主要生成多氯代二苯并-對(duì)-二噁英[16-18]。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of precision test

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取咪鮮胺原藥樣品，分別添加低、高2個(gè)加標(biāo)水平的17種二噁英類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(由二噁英類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液Ⅲ稀釋制得，各組分添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表4)，按照1.4 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算17種二噁英類化合物的回收率，結(jié)果列于表4。由表4可知，17種二噁英類化合物回收率為76.2%～115.8%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，滿足分析要求。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery test

3 結(jié)語

建立了同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定咪鮮胺原藥中17 種二噁英類化合物含量的方法，通過優(yōu)化提取方法，簡(jiǎn)化了樣品處理操作步驟。該方法實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高、選擇性好，可為包含咪鮮胺原藥在內(nèi)的含氯農(nóng)藥中二噁英類化合物的檢測(cè)提供技術(shù)支持。