刁飛燕，李俊婕，吳曉云，劉慧香，于海英，李啟艷

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局化妝品原料質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，特色植物資源化妝品濟(jì)南市工程研究中心，產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺(tái)，濟(jì)南 250101）

N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)，通用名為唾液酸(SA)。唾液酸是一類母體結(jié)構(gòu)為9個(gè)碳原子組成的神經(jīng)氨酸，是廣泛存在于生物系統(tǒng)中的一類天然糖類化合物。在大部分哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的唾液酸主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸，因此常把N-乙酰神經(jīng)氨酸稱為唾液酸[1-2]，已被證實(shí)其具有抗病毒、抗氧化、抗衰老等多種生理功效[3-5]，在化妝品中常用作保濕劑、皮膚保護(hù)劑等。燕窩、牛奶、乳制品等是N-乙酰神經(jīng)氨酸的主要天然來(lái)源[6-8]。N-乙酰神經(jīng)氨酸在2021年通過(guò)化妝品新原料注冊(cè)備案，成為國(guó)產(chǎn)化妝品新原料。

目前N-乙酰神經(jīng)氨酸的測(cè)定法主要有紫外可見分光光度法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]。比色法中采用間苯二酚顯色法測(cè)定N-乙酰神經(jīng)氨酸含量，操作繁瑣，化妝品原料基質(zhì)復(fù)雜，測(cè)定單一組分時(shí)易受干擾，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高；而液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定成本相對(duì)較高。目前尚無(wú)針對(duì)化妝品原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，難以保證原料的有效性、安全性。筆者選擇強(qiáng)陽(yáng)離子SCX 色譜柱，優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件，利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，解決了該原料極性大，在一般反相色譜柱中不能保留的難題，為化妝品原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸的質(zhì)量檢測(cè)提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT 型，日本島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司。

電子天平：MS105DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

純水儀：Milli-Q A10型，美國(guó)密理博公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-S6 型，山東博科科學(xué)儀器有限公司。

乙腈、甲醇：色譜純，德國(guó)默克公司。

磷酸、乙酸：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

N-乙酰神經(jīng)氨酸對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98%，美國(guó)西格瑪奧德里奇公司。

供試品原料：共11批，某企業(yè)提供。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由密理博純水儀制得。

1.2 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK SCX 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本資生堂公司)；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為80∶20)，流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；

1.3 溶液配制

N-乙酰神經(jīng)氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液：2 000 μg/mL，稱取N-乙酰神經(jīng)氨酸對(duì)照品適量，用2% (體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液稀釋并定容。

N-乙酰神經(jīng)氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：質(zhì)量濃度分別為10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/mL，分別準(zhǔn)確移取不同體積的N-乙酰神經(jīng)氨酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，用2%乙酸溶液稀釋制得。

樣品溶液：稱取供試品原料適量(其中含N-乙酰神經(jīng)氨酸約40 mg)，精密稱定，置于25 mL 比色管中，加入50% (體積分?jǐn)?shù)，下同)乙酸溶液10 mL 溶解，蓋上玻璃塞，置于80 ℃水浴中加熱30 min，取出比色管，冷卻至室溫。將水解液轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線，混勻，過(guò)孔徑為0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

空白對(duì)照溶液：除不加供試品外，其余測(cè)定步驟與樣品溶液制備步驟一致。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取N-乙酰神經(jīng)氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，按色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算樣品中的N-乙酰神經(jīng)氨酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 色譜柱

分別考察Symmetry Shield RP18 柱(簡(jiǎn)稱C18柱)、CAPCELL PAK SCX 柱( 簡(jiǎn) 稱SCX 柱) 和Hypersil GOLD AQ柱(簡(jiǎn)稱AQ柱)對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的保留行為。結(jié)果表明，C18柱和AQ柱對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸不易保留；SCX柱使用混合強(qiáng)陽(yáng)離子交換填料，具有離子交換和疏水作用雙重功能，選擇性強(qiáng)，延長(zhǎng)了N-乙酰神經(jīng)氨酸的保留時(shí)間，能實(shí)現(xiàn)對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的良好分離，且色譜峰形良好，故選擇CAPCELL PAK SCX 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分析柱。

2.1.2 流動(dòng)相

分別考察甲醇-0.1% (體積分?jǐn)?shù)，下同)磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1% (體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液3種流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，與甲醇相比，有機(jī)相選擇乙腈，色譜圖中雜質(zhì)峰較少；水相選擇水或0.1%甲酸溶液時(shí)，峰形較寬并前延，水相為0.1%磷酸溶液時(shí)，色譜峰形得到改善。

考察乙腈與0.1%磷酸溶液的體積比分別為90∶10、80∶20、70∶30對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，隨著水相比例的增加，N-乙酰神經(jīng)氨酸的保留時(shí)間延長(zhǎng)。當(dāng)乙腈與0.1%磷酸溶液的體積比為80∶20時(shí)，保留時(shí)間及峰形佳，最終選擇流動(dòng)相組成為乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為80∶20)。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)

采用高效液相色譜儀對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，所得光譜圖為典型的末端吸收曲線，參考最大吸收檢測(cè)波長(zhǎng)，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm。

2.2 樣品處理方法

唾液酸可分為游離態(tài)唾液酸和結(jié)合態(tài)唾液酸兩種形式，其中游離態(tài)唾液酸是未與糖或蛋白結(jié)合的唾液酸，樣品中結(jié)合態(tài)的唾液酸經(jīng)過(guò)加熱及酸處理，產(chǎn)生游離態(tài)的唾液酸[15]，超聲提取不能水解完全，需將樣品水浴加熱后測(cè)定，因此采取水解樣品處理方法，并考察不同水解溶劑、水解溫度、水解時(shí)間三個(gè)因素對(duì)提取結(jié)果的影響。

分別選擇50%乙酸溶液、0.5 mol/L硫酸氫鈉溶液、0.1 mol/L 硫酸溶液、1% (體積分?jǐn)?shù))磷酸溶液4種水解液進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，在相同溫度、相同水解時(shí)間條件下，以50%乙酸溶液和1%磷酸溶液為水解溶劑時(shí)，N-乙酰神經(jīng)氨酸含量測(cè)定值高于其余兩種水解溶劑，但經(jīng)1%磷酸溶液水解后樣品溶液顏色明顯加深，雜質(zhì)的色譜響應(yīng)值增大，目標(biāo)物檢出限略高，故選擇50%乙酸溶液為水解溶劑。

分別選擇水解溫度為30、40、60、80、100 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著水解溫度升高，目標(biāo)物測(cè)定值逐漸增大，當(dāng)水解溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，目標(biāo)物發(fā)生部分降解，測(cè)定值逐漸降低，故選擇水解溫度為80 ℃。

圖1 不同水解溫度時(shí)的測(cè)定結(jié)果Fig.1 Determination results of diffferent hydrolysis temperature

分別選擇水解時(shí)間為10、20、30、40、60 min 進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，當(dāng)水解時(shí)間為10～30 min 時(shí)，目標(biāo)物測(cè)定值逐漸增大；當(dāng)水解時(shí)間為30～60 min 時(shí)，目標(biāo)物測(cè)定值基本一致，故選擇水解時(shí)間為30 min。

圖2 不同水解時(shí)間時(shí)的測(cè)定結(jié)果Fig.2 Determination results of different hydrolysis time

2.3 方法專屬性

分別取空白對(duì)照溶液、N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，如圖3所示。

圖3 空白對(duì)照溶液、 N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank control solution，N-acetylneuraminic acid standard solution and sample solution

由圖3 可以看出，N-乙酰神經(jīng)氨酸保留時(shí)間約為6.8 min，色譜峰形良好?？瞻讓?duì)照溶液及樣品溶液基質(zhì)均無(wú)干擾，滿足試驗(yàn)要求，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性方程與檢出限、定量限

取N-乙酰神經(jīng)氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照質(zhì)量濃度由低到高的順序依次進(jìn)樣分析，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示N-乙酰神經(jīng)氨酸質(zhì)量濃度在10.0～500.0 μg/mL 范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性方程為y=5 420.15x-1 181.45，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

取N-乙酰神經(jīng)氨酸質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用2%乙酸溶液逐級(jí)稀釋，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限和定量限，該方法檢出限為0.12 μg/mL，定量限為0.4 μg/mL。

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

稱取樣品適量(其中含N-乙酰神經(jīng)氨酸約20 mg)，精密稱定，分別進(jìn)行低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行制備6份，按1.3方法制備加標(biāo)樣品溶液，按1.2色譜條件分別測(cè)定，計(jì)算N-乙酰神經(jīng)氨酸的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。由表1 可知，目標(biāo)組分的平均回收率為97.7%～98.9%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.37%～1.36%，表明該方法準(zhǔn)確度及精密度良好，滿足分析要求。

表1 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery and precision test

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.3 方法平行制備樣品溶液，分別于第0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算色譜峰面積，結(jié)果見表2。由表2可知，N-乙酰神經(jīng)氨酸色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.90%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of stability test

2.7 樣品測(cè)定

目前國(guó)家藥品監(jiān)督管理局公布的化妝品新原料備案信息中顯示，N-乙酰神經(jīng)氨酸在化妝品中使用時(shí)的最大允許質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，故檢測(cè)原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量對(duì)保障化妝品的質(zhì)量及安全使用具有重要意義。N-乙酰神經(jīng)氨酸制備方法主要是天然產(chǎn)物提取、化學(xué)合成法、酶法合成[16]、微生物發(fā)酵法[17]。備案新原料N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備方法為微生物發(fā)酵法，含量可達(dá)98%以上?！兑咽褂没瘖y品原料目錄(2021 年版)》收錄的燕窩提取物中含有N-乙酰神經(jīng)氨酸，因此選取燕窩提取物和N-乙酰神經(jīng)氨酸兩類原料進(jìn)行測(cè)定。

按所建方法測(cè)定11 批供試品原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量，其中1#～8#原料標(biāo)示為燕窩提取物，9#～11#標(biāo)示為N-乙酰神經(jīng)氨酸，測(cè)定結(jié)果見表3。由表3 可知，所測(cè)樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為6.2%～98.5%。6#、8#原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量測(cè)定值略低于標(biāo)示值，其余樣品測(cè)定值與標(biāo)示值相符。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination results of sample

3 結(jié)語(yǔ)

建立了檢測(cè)化妝品原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸的高效液相色譜方法。該法準(zhǔn)確、高效，未使用有機(jī)溶劑衍生，大幅降低了對(duì)人員和環(huán)境的影響。該法具有良好的線性、準(zhǔn)確度、精密度，為制定化妝品原料中N-乙酰神經(jīng)氨酸的含量測(cè)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。