譚超容，李小飄，冉俊艷，熊 英，廖尚高，張金娟，c，何 迅

貴州醫(yī)科大學(xué) a.藥學(xué)院，b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，c.慢性病診療轉(zhuǎn)化工程研究中心，貴陽(yáng) 550025

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化及肝癌的必經(jīng)階段，在早期階段及時(shí)干預(yù)治療則是可逆的［1］，但若不及時(shí)干預(yù)，將進(jìn)展為不可逆的肝硬化，甚至轉(zhuǎn)變成肝癌［2-4］，因此對(duì)肝纖維化的有效干預(yù)對(duì)于避免其惡性進(jìn)展具有重要意義。

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女性比男性具有更低的肝纖維化和肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)［5］，但進(jìn)入圍絕經(jīng)期雌激素分泌減少后，肝纖維化的發(fā)病率逐漸增加，這表明雌激素對(duì)肝臟具有保護(hù)作用［6］。內(nèi)源性的雌激素參與抗肝纖維化的保護(hù)作用已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［7-9］證據(jù)。然而，由于雌激素效應(yīng)較強(qiáng)，長(zhǎng)期過(guò)度使用雌激素治療肝纖維化可能導(dǎo)致廣泛的不良反應(yīng)［10］。相比之下，植物雌激素具有與雌激素相似的結(jié)構(gòu)［11］，被認(rèn)為具有潛在的弱雌激素效應(yīng)，臨床應(yīng)用相對(duì)安全［12-14］。鷹嘴豆芽素A（biochanin A，BCA）主要來(lái)源于豆科植物鷹嘴豆的種子胚芽部分、紅車軸草全草，屬于異黃酮類植物雌激素，有雌激素樣作用［15-18］。BCA還可延緩高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性肝損傷［19］，本課題組推測(cè)BCA 可能通過(guò)其弱雌激素作用發(fā)揮抗肝纖維作用，為此，本課題以CCl4誘導(dǎo)的雌性雙側(cè)卵巢切除（去勢(shì)）肝纖維化小鼠為模型，觀察植物雌激素BCA 對(duì)肝纖維化的作用及其機(jī)制，為開(kāi)發(fā)安全有效的抗肝纖維化植物雌激素藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 YP-SY96 型多功能酶標(biāo)儀（山東優(yōu)云譜光電科技有限公司）；101 型恒溫箱（上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；AB104-S型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，感量：0.1 mg）；MIULAB 型離心機(jī)（杭州米歐儀器有限公司）；Nikon Eclipse Eclipse E100 型正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康儀器有限公司）；DYY-6C 電泳液系統(tǒng)（北京六一生物有限公司）；NIKON DS-U3 成像系統(tǒng)（日本尼康儀器有限公司）。

1.2 藥物和試劑 BCA（批號(hào)N0901A，純度≥97%）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；雌二醇（批號(hào)J20171038，規(guī)格：1 mg）購(gòu)自DELPHARM Lille S.A.S；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)20220723）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；AST、ALT（批號(hào)分別為20220628、20220620）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TNF-α、IL-6（批號(hào)分別為FU02TDL61345、FU03N42H2910）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號(hào)#62U0922）購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）多克隆抗體（批號(hào)14395-1-AP）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）單克隆抗體、雌激素受體β（ERβ）多克隆抗體（批號(hào)分別為bs-0578R、bs20471R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）單克隆抗體（批號(hào)ab179695）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；兔抗鼠細(xì)胞核因子-κB（NF-κBp65）、磷酸化細(xì)胞核因子κB（p-NF-κBp65）單克隆抗體（批號(hào)分別為D14E12、93H1）均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；PVDF膜（批號(hào)R1DB89779）購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只昆明小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001，動(dòng)物房溫度保持在25 ℃左右，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模、分組與給藥 造模方法根據(jù)文獻(xiàn)［6，20］進(jìn)行。取50只雌性小鼠切除雙側(cè)卵巢以獲得去勢(shì)小鼠，同時(shí)取10 只同批雌性小鼠切除雙側(cè)卵巢旁少量脂肪組織作為假手術(shù)組。術(shù)后3 天，給予去勢(shì)小鼠腹腔注射20%CCl4橄欖油溶液，每周2 次，持續(xù)9 周，建立肝纖維化模型。假手術(shù)組小鼠以腹腔注射橄欖油代替CCl4。于CCl4誘導(dǎo)的第3周，將50只建模小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分成5組，即模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（雌二醇2 mg/kg）、BCA 低劑量組（25 mg/kg）、BCA 中劑量組（50 mg/kg）、BCA 高劑量組（100 mg/kg），每組10 只。分組后，陽(yáng)性對(duì)照組，BCA 低、中、高劑量組分別灌胃溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液的對(duì)應(yīng)藥物，模型組與假手術(shù)組灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續(xù)7周。

1.4.2 取材 末次給藥后24 h，麻醉各組小鼠，取血清，測(cè)定血清學(xué)指標(biāo)；剖取小鼠肝臟及子宮，部分肝組織保存于-80 ℃冰箱中，另一部分肝組織固定于10%中性福爾馬林中。

1.4.3 觀察肝臟、子宮外觀及計(jì)算肝指數(shù)、子宮指數(shù)肉眼觀察肝臟及子宮大小、質(zhì)地、顏色等外觀表現(xiàn)，稱重，按下列公式計(jì)算器官（肝、子宮）指數(shù)。器官指數(shù)（%）=器官質(zhì)量/末次體質(zhì)量×100%。

1.4.4 HE、Masson 染色觀察肝組織學(xué)改變 固定的肝組織經(jīng)不同濃度乙醇逐級(jí)脫水，浸蠟與包埋，切片，HE和Masson染色，鏡下觀察肝組織學(xué)變化。

1.4.5 檢測(cè)血清AST、ALT 活性 取血清，采用微板法測(cè)定血清中AST、ALT活性。

1.4.6 檢測(cè)肝組織中IL-6、TNF-α 水平 取-80 ℃冰箱中保存的肝組織制成勻漿液，采用ELISA 法測(cè)定肝組織中IL-6、TNF-α水平，操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.7 Wersten Blot 檢測(cè)肝組織中Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA、ERβ、p-NF-κBp65、NF-κBp65蛋白表達(dá)檢測(cè) 每組中隨機(jī)選取3 只小鼠進(jìn)行3 次Western Blot 重復(fù)實(shí)驗(yàn)。提取肝組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白變性，SDS 凝膠電泳2 h，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉2 h，TBST 緩沖液洗膜3次，分別加入Collagen Ⅰ（1∶2 000）、α-SMA（1∶2 000）、ERβ（1∶500）、TGF-β1（1∶1 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、p-NFκBp65（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）一抗，于4 ℃孵育過(guò)夜，隨后用TBST緩沖液洗PVDF膜3次，加二抗孵育2 h，TBST 緩沖液洗膜3 次，ECL 發(fā)光顯影，用Image J 軟件對(duì)各條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25～P75）表示，多組間比較及進(jìn)一步兩兩比較均采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCA對(duì)肝纖維化小鼠肝、子宮指數(shù)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠的子宮指數(shù)顯著降低（P＜0.05），肝指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，BCA 各劑量組的肝指數(shù)均明顯降低（P值均＜0.05），子宮指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組肝指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05），子宮指數(shù)明顯增大（P＜0.05）（表1）。

表1 BCA對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝、子宮指數(shù)的影響Table 1 Effects of BCA on liver and uterus weight ratios in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.2 BCA 對(duì)肝纖維化小鼠肝臟、子宮形態(tài)學(xué)及肝組織學(xué)的影響 肝臟外觀觀察發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組小鼠肝臟外觀表面光滑，質(zhì)地柔軟，邊緣銳；模型組小鼠肝臟表面有明顯的粗顆粒狀，質(zhì)地硬，邊緣圓鈍；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和BCA 各劑量組肝臟表現(xiàn)有不同程度的改善。子宮：假手術(shù)組小鼠子宮形態(tài)正常，模型小鼠明顯比假手術(shù)組小鼠子宮纖細(xì)；而陽(yáng)性對(duì)照組小鼠子宮明顯比模型組子宮增粗，BCA 各劑量組小鼠子宮大小與模型組小鼠無(wú)明顯差異。HE 染色：假手術(shù)組肝細(xì)胞形態(tài)正常，小葉結(jié)構(gòu)清晰且完整，未出現(xiàn)細(xì)胞壞死和脂肪變性、炎癥等；模型組肝細(xì)胞有水腫、脂肪空泡、壞死等表現(xiàn)，細(xì)胞排列紊亂，小葉結(jié)構(gòu)不完整，并伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA 各劑量組肝組織表現(xiàn)較不同程度減輕。Masson 染色：假手術(shù)組小鼠肝組織匯管區(qū)有少量藍(lán)色膠原纖維，小葉結(jié)構(gòu)正常；模型組肝組織內(nèi)有大量粗大的藍(lán)色膠原纖維，交錯(cuò)分布，導(dǎo)致小葉結(jié)構(gòu)被破壞；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA 各劑量組藍(lán)色膠原纖維較細(xì)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度減輕（圖1）。

圖1 BCA對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠子宮、肝臟形態(tài)學(xué)及肝臟病理的影響Figure 1 Effects of BCA on the morphological and pathological changes of uterus and liver in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.3 BCA 對(duì)肝纖維化小鼠血清中AST、ALT 活性的影響與假手術(shù)組相比較，模型組小鼠血清AST、ALT均顯著升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA各劑量組小鼠血清AST、ALT均顯著降低（P值均＜0.05）（表2）。

表2 BCA對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠AST、ALT活性的影響Table 2 Effects of BCA on serum activities of AST and ALT in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.4 BCA對(duì)肝纖維化小鼠肝組織中IL-6、TNF-α水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α 均顯著升高（P值均＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA 各劑量組小鼠肝組織中IL-6、TNF-α 均顯著降低（P值均＜0.05）（表3）。

表3 BCA對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠IL-6、TNF-α水平的影響Table 3 Effects of BCA on serum contents of IL-6 and TNF-α in CCl4-induced liver fibrosis mice

2.5 BCA對(duì)肝纖維化小鼠肝組織中Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA、ERβ、p-NF-κBp65/NF-κBp65 蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比較，模型組小鼠肝組織Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA 相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P值均＜0.05），與模型組比，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA 低、中、高劑量組小鼠的肝組織Collagen Ⅰ、TGF-β1、α-SMA 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P值均＜0.05）。

與假手術(shù)組相比，模型組小鼠肝組織ERβ相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA 中、高劑量組小鼠肝組織ERβ 相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P值均＜0.05），BCA 低劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組相比較，模型組小鼠的p-NF-κBp65/NF-κBp65相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組及BCA中、高劑量組小鼠中的p-NF-κBp65/NF-κBp65相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P值均＜0.05）（表4，圖2）。

圖2 BCA對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of BCA on protein expressions in CCl4-induced liver fibrosis mice

表4 BCA對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝組織中蛋白表達(dá)的影響Table 4 Effects of BCA on protein expressions in CCl4-induced liver fibrosis mice

3 討論

本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上對(duì)BCA 可能通過(guò)其弱雌激素作用發(fā)揮抗肝纖維化作用進(jìn)行驗(yàn)證。本課題的創(chuàng)新點(diǎn)在于，為觀察植物雌激素BCA 對(duì)子宮的影響選用了雌性小鼠，同時(shí)為了避免體內(nèi)雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，對(duì)雌性小鼠進(jìn)行了去勢(shì)處理。CCl4具有肝毒性，以CCl4誘導(dǎo)動(dòng)物肝纖維化是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的肝纖維化造模的經(jīng)典方法［21-22］。本課題對(duì)去勢(shì)雌性小鼠腹腔注射CCl4制作肝纖維化模型，結(jié)果在肉眼及鏡下觀察均可見(jiàn)模型組小鼠肝組織出現(xiàn)了典型的肝纖維化表現(xiàn)，表明造模成功。

血清中AST 和ALT 活性是檢測(cè)肝功能損傷程度的靈敏指標(biāo)［23］，結(jié)果顯示，模型組AST、ALT 活性較假手術(shù)組顯著升高，表明模型組小鼠存在顯著的肝損傷。肝星狀細(xì)胞（HSC）的激活在肝纖維化進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用［24］。HSC 合成過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），在肝內(nèi)沉積，促進(jìn)肝纖維化的形成。Collagen Ⅰ是ECM 的主要成分之一，模型組小鼠肝組織中Collagen Ⅰ表達(dá)上調(diào)，表明模型組小鼠肝組織內(nèi)存在過(guò)多ECM。α-SMA 是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志蛋白，其過(guò)量表達(dá)提示HSC 過(guò)度激活分泌ECM，加速肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展［25］，還間接反映HSC 在機(jī)體內(nèi)活化增殖的進(jìn)度與纖維化進(jìn)展的嚴(yán)重程度［26］。TGF-β1是引起HSC 活化最有效的細(xì)胞因子之一，介導(dǎo)HSC 活化和生成ECM，是肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵介質(zhì)，參與肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用［27-28］。Western Blot 結(jié)果表明，模型組小鼠肝組織α-SMA、TGF-β1表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加，表明模型組小鼠肝組織中肝星狀細(xì)胞顯著活化，生成ECM能力明顯增強(qiáng)。

與模型組相比，經(jīng)高、中、低劑量的BCA 干預(yù)后，BCA 各組小鼠血清AST、ALT 活力明顯降低，肝組織中Collagen Ⅰ、α-SMA、TGF-β1表達(dá)下調(diào)，肝組織病變程度也明顯減輕，表明BCA 處理可減少小鼠肝組織中ECM的生成，降低HSC 的活化，減輕肝組織纖維化病變程度，提示BCA 可有效改善CCl4誘導(dǎo)的雌性去勢(shì)小鼠的肝纖維化。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還觀察到模型小鼠因體內(nèi)雌激素缺乏而出現(xiàn)子宮萎縮、子宮指數(shù)減小的表現(xiàn)；給予雌激素處理后，改善肝纖維化的同時(shí)也使子宮增大。而BCA 僅改善了肝纖維化，對(duì)子宮未產(chǎn)生明顯影響，提示BCA 的雌激素樣作用弱，對(duì)子宮等其他雌激素相關(guān)器官影響不大?？梢酝茰y(cè)，若將其替代雌激素用于肝纖維治療，可一定程度上降低患子宮癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

肝纖維化發(fā)展的全過(guò)程中伴有炎癥的發(fā)生［29］，控制肝臟炎癥可在一定程度上逆轉(zhuǎn)肝纖維化［30］。NF-κB 是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子［31］，是NF-κB信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子。NF-κB 信號(hào)通路作為經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。TNF-α、IL-6 等炎癥因子可作為NF-κB 信號(hào)通路的配體激活NF-κB 通路，被激活的NF-κB 轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。TNF-α、IL-6 等基因的啟動(dòng)子區(qū)具有NF-κB的結(jié)合點(diǎn)［32］，被NF-κB激活后又進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，形成炎癥反應(yīng)惡性循環(huán)。NF-κB 家族由RelA（p65）、RelB、c-Rel、p50（NF-κB1）和p52（NF-κB2）5 個(gè)成員組成，可形成不同形式的同源二聚體或異二聚體。其中p65 蛋白的相關(guān)研究最多，是經(jīng)典的NF-κB 信號(hào)通路傳導(dǎo)過(guò)程中的關(guān)鍵分子，磷酸化后的p65為其活性形式。本研究發(fā)現(xiàn)，BCA中劑量、高劑量組肝纖維小鼠肝組織中p65 蛋白的磷酸化修飾水平降低，提示BCA 可抑制NF-κB 信號(hào)通路，打破炎癥反應(yīng)惡性循環(huán)，降低TNF-α、IL-6 等炎癥因子水平，減輕肝臟炎癥反應(yīng)。

BCA 作為植物雌激素，往往可通過(guò)雌激素受體發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)，BCA 中劑量、高劑量干預(yù)的肝纖維化小鼠肝組織中ERβ 表達(dá)明顯增高，以BCA 與ERβ 進(jìn)行分子對(duì)接也顯示結(jié)合能較好，提示BCA可通過(guò)ERβ發(fā)揮作用。通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ERβ可抑制NF-κB信號(hào)通路。例如三陰性乳腺癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)ERβ 時(shí)，NF-κB表達(dá)降低，兩者表達(dá)呈明顯的相關(guān)性［33］。此外，過(guò)表達(dá)ERβ 可通過(guò)降低IκBα 及p65 的磷酸化水平抑制NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及增殖［34］。由此，可以合理推測(cè)，BCA 可通過(guò)上調(diào)ERβ 的表達(dá)而抑制NF-κB 信號(hào)通路，從而減輕肝纖維化小鼠肝組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善肝纖維化。

綜上所述，BCA 可有效改善CCl4誘導(dǎo)的雌性去勢(shì)小鼠的肝纖維化病變，且具有對(duì)子宮等雌激素靶器官影響較小的優(yōu)勢(shì)，其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)ERβ 抑制NFκB信號(hào)通路，減輕炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。

倫理學(xué)聲明：本課題實(shí)驗(yàn)方案于2021年7月9日獲得貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2100313，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：譚超容參與課題的設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)課題實(shí)施，數(shù)據(jù)分析，撰寫論文；李小飄、冉俊艷、熊英、廖尚高參與課題實(shí)施，數(shù)據(jù)收集，修改論文；張金娟、何迅負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)實(shí)施及文章撰寫并定稿。