王恒波 馮春燕 張以星 謝婉婕 杜翠翠 吳明星 張積森

1 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家甘蔗工程技術(shù)研究中心 / 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建福州 3500022；2 廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧，530004

NAC是由No Apical Meristem (NAM)、Arabidopsistranscription activation factor (ATAF)、Cup-shaped Cotyledon (CUC2)這3類基因的首字母命名, 是僅存于陸生植物、成員數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[1]。Ooka等按照NAC蛋白的結(jié)構(gòu)域特征, 將其分為2大類(Group Ι和Group II), 進(jìn)一步還可分為18個(gè)亞家族, 不同亞家族成員間執(zhí)行相似的生物學(xué)功能[2]。NAP (NAC-Like, Activated by Apetala3/Pistillata)屬NAC家族Group Ι類的第4個(gè)亞家族。第一個(gè)NAP基因是1998年從擬南芥上鑒定的NAC家族成員,也是調(diào)控花器官發(fā)育基因AP3/PI(Apetala3/Pistillata)的靶標(biāo)基因[3], 該基因的表達(dá)量與葉片衰老程度呈正相關(guān), 過(guò)表達(dá)擬南芥植株出現(xiàn)早熟性衰老表型,而atnap突變體的衰老表型出現(xiàn)延遲, 或者擬南芥atnap突變體中轉(zhuǎn)入水稻和菜豆同源基因能夠回補(bǔ)atnap突變體的滯綠表型[4]。因此, 前人將陸生植物NAC家族中與AtNAP的同源基因, 且能夠調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和葉片衰老的一類基因命名為NAP亞家族。該亞家族不僅有NAC家族典型的特殊結(jié)構(gòu)特征,即在N端含有的高度保守NAM結(jié)構(gòu)域, 可進(jìn)一步分為A、B、C、D和E亞結(jié)構(gòu)域[5], 其中亞結(jié)構(gòu)域B的保守基序?yàn)镾II[PA][ED][VI]D[IL]YKFDPW[ED]LP, 而且在其C端的轉(zhuǎn)錄激活域中存在相對(duì)特異基序, 如: IFSDIYDGG和YQIPGLNWY序列[6], 這些結(jié)構(gòu)特征對(duì)于識(shí)別與調(diào)控下游靶標(biāo)基因可能起到關(guān)鍵調(diào)控作用[7-8]。

目前, NAP亞家族基因已在大豆(Glycinemax)、葡萄(Vitisvinifera)、番紅花(Crocussativa)、金魚(yú)藤(Asarinaprocumbens)、紫花苜蓿(Medicagosativa)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、水稻(Oryzasativa)及甘蔗熱帶種(Saccharumofficinarum)等植物中被鑒定、克隆和功能分析[2,9-11]。在大豆中,GmNAC1基因主要在根、花及授粉后35 d的種子呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)[12]。在葡萄中,VvNAP基因在成熟的花及果實(shí)中表現(xiàn)出高表達(dá)[13], 而番紅花的CsNAP基因也在成熟的花中表達(dá)[14], 二者呈現(xiàn)相似表達(dá)模式, 深入分解番紅花的花, 其在雄蕊和內(nèi)層苞片上呈現(xiàn)高表達(dá)。從金魚(yú)藤(Asarinaprocumbens)和紫花苜蓿(Medicagosativa)衰老葉片中克隆獲得的ApNAP和MsNAP基因[15-16], 在衰老葉片中的表達(dá)量都遠(yuǎn)高于幼嫩葉片。棉花的GhNAP8在4℃、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)和脫落酸(abscisic acid,ABA)脅迫下可被誘導(dǎo)表達(dá), 且在處理后5～10 h時(shí),表達(dá)量達(dá)到最高[17]。水稻OsNAP基因在油菜素內(nèi)酯、ABA、SA、茉莉酸(jasmonic acid, JA)、赤霉素、生長(zhǎng)素等激素調(diào)控及低溫、干旱、鹽等非生物脅迫下[18], 發(fā)現(xiàn)其僅受ABA誘導(dǎo)調(diào)控葉片衰老, 過(guò)表達(dá)株系較早表現(xiàn)衰老表型, 沉默株系顯著延遲衰老;內(nèi)源茉莉酸含量測(cè)定顯示, 過(guò)表達(dá)株系茉莉酸含量增加, 而沉默株系茉莉酸含量顯著降低; 對(duì)JA合成通路相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)株系中JA通路相關(guān)基因的脂氧合酶2 (lipoxygenase 2, LOX2)與含銅胺氧化酶1 (amine oxidase copper-containing 1, AOC1)呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá), 使得JA含量增加, 而沉默株系JA合成通路相關(guān)基因丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase, AOS)、AOC1和氧-植物二烯酸還原酶(oxo-phyytodienoic acid reductase 7, OPR7)呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá), 導(dǎo)致JA含量下降[19]。在甘蔗熱帶種(Saccharumofficinarum)中, Carrillo-Bermejo等克隆獲得SoNAP基因, 高鹽、干旱和脫落酸處理均能誘導(dǎo)SoNAP基因表達(dá); 其編碼的蛋白定位于細(xì)胞核;在煙草愈傷組織中瞬時(shí)過(guò)表達(dá)SoNAP基因, 愈傷組織呈現(xiàn)衰老相關(guān)的表型[20]。以上結(jié)果表明,NAP基因不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程, 尤其是對(duì)于根、莖、葉和花等組織器官形成, 并且能夠響應(yīng)激素和非生物介導(dǎo)植物組織衰老和逆境脅迫的生物學(xué)過(guò)程。

甘蔗(Saccharumspp. hybrid)是世界上重要的糖料作物和能源作物, 其產(chǎn)糖量占世界食糖總量的80%, 能源乙醇占世界乙醇總產(chǎn)量的26%[21]。我國(guó)作為世界第3大蔗糖生產(chǎn)國(guó), 甘蔗主產(chǎn)區(qū)位于氣候較為干旱和土壤較為貧瘠的廣西和云南地區(qū), 不良的立地環(huán)境導(dǎo)致甘蔗葉片較早衰老、光合作用下降,引起甘蔗蔗糖含量和產(chǎn)量嚴(yán)重下降, 進(jìn)而威脅甘蔗產(chǎn)業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展[22-23]。因此, 基于比較基因組學(xué)挖掘NAC家族中參與葉片衰老相關(guān)基因, 可以為甘蔗抗逆分子育種提供候選基因資源。在課題組前期研究中, 在甘蔗割手密種12 d幼嫩葉片發(fā)育梯度和不同發(fā)育時(shí)期蔗莖的轉(zhuǎn)錄組分析中, 發(fā)現(xiàn)NAP亞家族成員隨著葉片和蔗莖的衰老, 其表達(dá)量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì), 初步推測(cè)其可能參與葉片衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此, 在本研究中, 我們擬先對(duì)甘蔗割手密種NAP亞家族成員進(jìn)行鑒定, 系統(tǒng)進(jìn)化分析和啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件預(yù)測(cè); 其次, 克隆SsNAP2a基因, 分析其在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、激素和非生物脅迫下的表達(dá)模式; 最后, 進(jìn)行亞細(xì)胞定位和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)的功能分析。研究結(jié)果對(duì)于解析甘蔗割手密種NAP亞家族成員參與葉片衰老的生物學(xué)功能奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ), 也為將來(lái)基因工程技術(shù)選育抗衰老甘蔗新品種提供候選靶標(biāo)基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘蔗割手密種Np-X基因組、蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源(http://sugarcane.zhangjisenlab.cn/sgd/html/download.html,https://www.life.illinois.edu/ming/downloads/Spontaneum_genome/)。菠蘿和高粱基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分別來(lái)自(http://pineapple.angiosperms.org/pineapple/html/index.html,http://www.phytozame.net/)網(wǎng)站。本研究基因克隆和表達(dá)模式分析采用甘蔗割手密種SES208, 來(lái)自于福建農(nóng)林大學(xué)金山校區(qū)甘蔗基地。本氏煙草、載體pMDC202、pSuper1300均由福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院植物基因組中心提供。大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)菌株DH5α購(gòu)買于大連寶生物(TaKaRa)公司, 農(nóng)桿菌(Argobacteriumtumefaciens)感受態(tài)GV3101購(gòu)買于上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘蔗割手密種NAP亞家族成員的挖掘及比較基因組學(xué)分析 以7個(gè)水稻的NAP亞家族序列作為查詢序列, 運(yùn)用BLASTP程序, 鑒定到割手密種、高粱和菠蘿的候選NAP亞家族成員, 再與103個(gè)水稻NAC家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類分析[2],詳細(xì)步驟參照范凱[9]的方法。依據(jù)該方法, 從割手密種NP-X基因組中共獲得5個(gè)SsNAP亞家族成員, 命名為SsNAP1～SsNAP5。最后, 將鑒定的家族成員提交Pfam (http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)數(shù)據(jù)庫(kù)和SMART (http://smart.embl.de/) 數(shù)據(jù)庫(kù)分析保守結(jié)構(gòu)域。水稻和擬南芥NAP亞家族成員依據(jù)Ooka等[2], 玉米的NAP成員依據(jù)范凱等[9]報(bào)道。理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位、Ka/Ks比值、motif基序、多序列比對(duì)、系統(tǒng)演化樹(shù)、順式作用元件預(yù)測(cè)等生物信息分析參照方法[23-25]。

1.2.2 甘蔗割手密種NAP成員基因的克隆和序列分析 運(yùn)用甘蔗割手密種和高粱NAP亞家族5個(gè)基因成員的cDNA序列為種子序列和TBtools軟件的BLAST程序Blast Zone功能[23,26], 篩選到SsNAP2的同源基因序列(PB.7608.2), 以該序列為模板, 使用Snap Gene v5.2軟件在起始密碼子ATG和終止密碼子的設(shè)計(jì)特異性克隆引物, 并以割手密種SES208不同組織(根、莖、葉)混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[23],并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠(濃度為1.2%)電泳, 利用Omega Bio-Tek公司的膠回收試劑對(duì)預(yù)期大小的目標(biāo)產(chǎn)物條帶進(jìn)行純化回收, 并連接至TaKaRa公司的pEASY-Blunt Zero Cloning載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 將已鑒定的陽(yáng)性菌落送福州白鯨生物科技有限公司測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果正確的基因命名為SsNAP2a。

1.2.3 割手密種植株的取樣與處理 對(duì)甘蔗割手密種SES208植株的蔗莖切段, 用1%的多菌靈浸泡1 h后, 換清水浸泡2～3 d、待蔗芽萌發(fā)后, 用栽培土種植于溫室(30℃, 60% Relative humidity)下培養(yǎng)20 d獲得無(wú)性苗。選擇生長(zhǎng)高度和長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)接近的幼苗作為試驗(yàn)材料, 分別在4℃ (模擬低溫)和40℃ (模擬高溫)脅迫下處理, 分別采集0、12、24、48、72 h的葉片樣品; 另外, 將培養(yǎng)的幼苗分別用0.1 mmol L–1脫落酸(abscisic acid, ABA)和1 mmol L–1乙烯利(ethylene, ET)噴施葉片, 具體參照蘇亞春等[27]的方法, 采集0、3、6、12和24 h的葉片樣品。此外, 將溫室培養(yǎng)15 d的無(wú)性繁殖苗用Coolaber公司的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培, 每4 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液, 適應(yīng)性培養(yǎng)5 d后, 用8%聚乙二醇(polyethylene glycol)PEG-6000 (模擬干旱)配置成8%的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液脅迫植株, 采集0、12、24、48、72 h的葉片樣品。上述提到的樣品均以5株葉片為1個(gè)生物學(xué)重復(fù), 每個(gè)處理樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。本研究中割手密種植株不同生長(zhǎng)發(fā)育階段樣品的采集和處理參考杜翠翠等[25]、張旭等[24]和蘇亞春等[27]方法。

1.2.4 基因的表達(dá)量檢測(cè)與分析 利用Omega Bio-Tek公司的RNA提取試劑盒分離并純化植株組織及脅迫的樣品RNA, 并按照Gene Star公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明, 將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,稀釋濃度到50 g L-1, 以此為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)擴(kuò)增的模板。以SsNAP2a基因?yàn)槟繕?biāo)基因和泛素綴合酶E2 (ubiquitinconjugating enzyme E2,UBC)為內(nèi)參基因, 借助Primer premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)定量PCR引物(表1)。具體參考杜翠翠等[25]的qRT-PCR反應(yīng)體系和程序, 采用3×3法(3個(gè)技術(shù)重復(fù), 3個(gè)生物學(xué)重復(fù))在熒光定量PCR儀(Bio-Rad CFX96 Connect Real-Time PCR Detection System, 美國(guó)伯樂(lè))上進(jìn)行基因表達(dá)量的檢測(cè)。定量檢測(cè)結(jié)果的顯著性分析[28]、作圖及圖片處理均參照王恒波等分析方法[23,25]。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.5 SsNAP2a蛋白的亞細(xì)胞定位 以SalI和KpnI酶切位點(diǎn)為擴(kuò)增引物接頭和含有SsNAP2a基因全長(zhǎng)序列的質(zhì)粒為模板(表1), 詳細(xì)的載體構(gòu)建方法參考杜翠翠等[25], 獲得含有pSuper1300-35S::SsNAP2a::GFP載體和空載pSuper1300-35S::GFP的農(nóng)桿菌菌液, 并培養(yǎng)到菌液OD600為0.8后, 加入5 mL懸浮液(10 mmol L–1Morpholino ethane sulphonic,MES、10 mmol L–1MgCl2和200 μmol L–1乙酰丁香酮, pH 5.0～5.4)將菌液重懸, 利用針筒注射煙草葉片,詳細(xì)步驟參考王恒波等[23]和Liu等[29]方法。

1.2.6SsNAP2a基因在煙草中的瞬時(shí)表達(dá) 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建參考杜翠翠等[25]的方法, 完成農(nóng)桿菌活化后, 對(duì)5～6葉齡的本氏煙草葉片進(jìn)行注射,在24℃、60% RH培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng), 1 d澆水一次,收集過(guò)表達(dá)處理的0 d、2 d、7 d葉片樣品, 詳細(xì)的煙草黑暗處理參考申娟娟[30]和蘇亞春等[27]方法。通過(guò)對(duì)煙草免疫相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè), 并DAB 組織化學(xué)法測(cè)定過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)含量[23,25,27]。具體煙草免疫相關(guān)標(biāo)記基因NtHSR201和NtHSR203; 水楊酸(salicylic acid, SA)合成相關(guān)基因NtPR-1a/c[31]; 茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)合成相關(guān)基因NtPR3; ABA合成相關(guān)醛脫氫酶基因NtAREB1[32]; 乙烯合成相關(guān)基因NtEFE26和NtAccdeaminase[33];NtEF-1α作煙草的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗割手密種NAP亞家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

基于甘蔗割手密種的基因組數(shù)據(jù)和水稻、玉米、高粱、擬南芥已報(bào)道NAP亞家族成員, 共獲得5個(gè)有典型 NAM結(jié)構(gòu)域的NAP亞家族成員(SsNAP1～SsNAP5), 與近緣種高粱NAP亞家族成員數(shù)量一致(表2)。生物信息學(xué)分析顯示, 所有亞家族成員的氨基酸殘基數(shù)量分布在340 (SsNAP3)～409 (SsNAP5) aa,其開(kāi)放讀閱讀框在970～1273 bp 之間, 相對(duì)分子量介于36.933～44.912 kD之間, 其理論等電點(diǎn)分布6.06～9.04之間, 有2個(gè)成員的等電點(diǎn)大于7, 屬堿性蛋白, 有3個(gè)蛋白的等電點(diǎn)小于7, 屬酸性蛋白,且所有蛋白的平均疏水性為負(fù)值和不穩(wěn)定系數(shù)都大于41, 表明該亞家族成員是親水性穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 表明所有成員均定位于細(xì)胞核上。利用高粱與甘蔗割手密種NAP亞家族直系同源基因?qū)? 評(píng)估該基因在物種演化過(guò)程中受到的選擇壓力, 從表2中可以得出, 所有成員的Ka/Ks比值都小于1, 揭示純化選擇在該亞家族的演化中起到關(guān)鍵作用。

表2 甘蔗割手密種NAP亞家族成員的理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of NAP subfamily members in Saccharum spontaneum

2.2 不同物種NAP家族成員蛋白的序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將擬南芥的AtNAP、菜薹的BrNAP、水稻的OsNAP、高粱的SbNAP2和甘蔗割手密種的5個(gè)NAP亞家族成員進(jìn)行多序列比對(duì), 結(jié)果如圖1所示, 所有NAP成員的N端都有NAC轉(zhuǎn)錄因子的典型NAM結(jié)構(gòu)域特征, 該結(jié)構(gòu)域可分為5個(gè)保守的A、B、C、D和E亞結(jié)構(gòu)域, 其中B亞結(jié)構(gòu)域?yàn)镹AP亞家族特有的保守結(jié)構(gòu)域I[V]P[A]EVDIYKFDPWDLPA[E]KA[T]。C端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域(transcriptional activation region, TAR), 序列差異大, 保守性較低。其中SsNAP2與近緣屬物種高粱直系同源基因SbNAP2的蛋白相似性為74.36%,Ka/Ks比值為0.65, 揭示該基因受到較強(qiáng)選擇壓力, 也表明從共同祖先中分化的直系同源基因可能執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。

圖1 不同NAP成員的氨基酸序列比對(duì)Fig. 1 Amino acid sequence alignment of the different NAP members

為了解NAP亞家族成員的分子進(jìn)化模式, 選擇在物種演化過(guò)程中5個(gè)代表性被子植物(擬南芥、菠蘿、水稻、玉米和高粱)NAP亞家族成員和其他12個(gè)已報(bào)道NAP基因功能的物種, 利用MEGA7和IQ-tree v2.0.7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 將鑒定和收集的46個(gè)NAP亞家族成員分為4個(gè)Clade (I、II、III和IV) (圖2), Clade I的成員數(shù)最少, 僅有雙子葉植物的3個(gè)成員, 屬于相對(duì)古老亞族成員; CladeⅡ的成員數(shù)量最多, 有19個(gè)成員, 包含有雙子葉植物和單子葉植物NAP成員; Clade III和Clade IV數(shù)量次之, 分別有15個(gè)和8個(gè)成員, 都是來(lái)自單子葉植物,兩者都屬于較新分化成員, 其中割手密種SsNAP1、SsNAP2、SsNAP3屬于Clade III; SsNAP4、SsNAP5屬于Clade IV。從聚類關(guān)系表明NAP亞家族演化的時(shí)間順序Clade I > Clade II > Clade III > Clade IV。Clade II的一個(gè)相對(duì)獨(dú)立分支是由單子葉和雙子葉植物成員都聚類在一起形成, 表明該部分成員起源于單雙子葉分化之前, 可能執(zhí)行相對(duì)保守的功能;但該分支中僅有菠蘿、水稻和玉米的NAP成員, 沒(méi)有高粱和甘蔗的, 推測(cè)在高粱和甘蔗的共同祖先中,該分支的成員可能發(fā)生丟失。從不同物種NAP亞家族成員數(shù)量分析, 擬南芥有5個(gè), 單子葉植物的菠蘿有3個(gè)、水稻有7個(gè)、玉米有6個(gè)、高粱有5個(gè)和割手密種有5個(gè), 表明從被子植物共同祖先分化而來(lái), 單子和雙子葉植物的NAP成員數(shù)量變化不大,相對(duì)保守。

圖2 NAP亞家族成員的系統(tǒng)演化樹(shù)和保守結(jié)構(gòu)域Fig. 2 Phylogenetic tree and the conserved motifs of NAP subfamily members from some species

運(yùn)用MEME軟件在不同物種NAP亞家族成員中查找到10個(gè)保守的Motif (圖2), 其與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分類結(jié)果基本一致, 從圖2可以得出, 所有NAP成員N端部分氨基酸殘基相對(duì)保守(1～200 aa), 都由Motif3、Motif5、Motif1、Motif2、Motif4組成, 其分別對(duì)應(yīng)NAM結(jié)構(gòu)域的A亞結(jié)構(gòu)域是Motif3, B亞結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)是Motif5, C亞結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)是Motif1, D亞結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)是Motif2, E亞結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)是Motif4。而C端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域TAR, 保守性相對(duì)較低, 其中大部分成員有Motif6, 屬于該亞家族保守基序;而Motif8和Motif10屬于Clade III特有基序類型,Motif7僅是Clade II和Clade IV的特有基序。我們推測(cè), NAP亞家族在物種演化過(guò)程中, 不同分支成員保守基序的差異引發(fā)功能上的分化。

2.3 甘蔗割手密種NAP亞家族成員的順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)

啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 并在植物應(yīng)答逆境脅迫中發(fā)揮重要作用[34]。利用PlantCARE生物信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)并統(tǒng)計(jì)NAP亞家族成員的順式調(diào)控元件類型和數(shù)量, 剔除未知功能、啟動(dòng)子核心(TATA-box和CAAT-box)和光響應(yīng)元件后,一共預(yù)測(cè)到198個(gè)元件, 包括激素響應(yīng)元件88個(gè)、非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)元件54個(gè)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控相關(guān)50個(gè)和生長(zhǎng)與發(fā)育相關(guān)元件6個(gè)(圖3), 其中SsNAP2和SsNAP4預(yù)測(cè)的調(diào)控元件數(shù)量最多, 分別為47個(gè)和55個(gè), 其他成員元件數(shù)量分布在29～34個(gè)間。在激素響應(yīng)元件中, ABA和MeJA響應(yīng)元件數(shù)量最多,分別有41個(gè)和44個(gè), 兩者占激素元件總數(shù)的96.59%。在非生物脅迫響應(yīng)元件中, 低溫響應(yīng)元件有24個(gè)、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件有21個(gè), 分別占比非生物脅迫元件總數(shù)的44.44%和38.89%。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)響應(yīng)元件中, 所有成員都預(yù)測(cè)到響應(yīng)干旱和耐鹽的MYB和MYC元件, 二者占比為92%, 其余為WRKY轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的元件。而在生長(zhǎng)與發(fā)育相關(guān)響應(yīng)元件中, 僅有6個(gè)分生組織表達(dá)響應(yīng)元件。以上該亞家族成員啟動(dòng)子順式調(diào)控元件的預(yù)測(cè)結(jié)果, 對(duì)SsNAP成員的生物學(xué)功能分析和挖掘提供了重要研究基礎(chǔ)。

圖3 順式作用元件預(yù)測(cè)Fig. 3 Cis-acting elements prediction

2.4 甘蔗割手密種SsNAP2a基因的克隆及生物信息分析

依據(jù)甘蔗割手密種同源四倍體Np-X基因組注釋SsNAP成員的CDs序列和同源八倍體SES208的PacBio三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 通過(guò)比對(duì)獲得一條相似性高的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列(PB.5313.1), 以此序列設(shè)計(jì)克隆引物(表1), PCR擴(kuò)增并獲得預(yù)期目標(biāo)片段,經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序驗(yàn)證后, 其開(kāi)放讀碼框?yàn)?173 bp, 編碼390個(gè)氨基酸, 由1個(gè)NAM superfamily (pfam02365, 位于17～142 aa)結(jié)構(gòu)域組成, 將其蛋白序列與5個(gè)SsNAPs亞家族成員序列相似性進(jìn)行比較, 發(fā)現(xiàn)與SsNAP2(等位基因XSsp.02D037500.1)蛋白的氨基酸序列相似性高達(dá)97.70%, 僅存在10個(gè)氨基酸殘基的差異, 命名為SsNAP2a, GenBank登錄號(hào)為OQ335094, 而與其他成員蛋白相似性分布在54.41%～68.75%之間, 表明該亞家族成員可能執(zhí)行不同生物學(xué)功能, 也揭示同源8倍體甘蔗割手密種等位基因序列間存在較大差異(圖4)。生物信息分析顯示, 該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋(22.10%)、β折疊(12.40%)和無(wú)規(guī)則卷曲(65.50%)組成, 分子量為40.13 kD, 等電點(diǎn)為7.74,分別由35個(gè)酸性氨基酸殘基(Asp + Glu)和36個(gè)堿性氨基酸殘基(Arg + Lys)組成, 帶正電荷與帶負(fù)電荷殘基相差小, 屬于偏堿性蛋白, 平均親水性為0.426, 表明該蛋白為疏水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明, 該蛋白定位于細(xì)胞核上。

圖4 SsNAP2a基因的核酸序列及編碼的氨基酸序列Fig. 4 Nucleic acid sequence and the coding amino acid sequence of SsNAP2a gene

2.5 SsNAP2a基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子NAP是調(diào)控植物組織的生長(zhǎng)發(fā)育與葉片衰老等生理過(guò)程的關(guān)鍵基因[6]。本研究采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了SsNAP2a基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中的相對(duì)表達(dá)量(圖5)。結(jié)果顯示,SsNAP2a基因在+1葉、根和蔗皮6中的表達(dá)量最高, 分別為葉鞘的70.6、33.5和39.8倍; 其在幼嫩蔗皮3、蔗芽和卷葉中的表達(dá)量次之, 且三者間的表達(dá)量差異不顯著, 但都與葉鞘中的表達(dá)量有顯著差異; 然而,其在蔗肉3、蔗肉6與葉鞘中的表達(dá)量最低, 且無(wú)顯著性差異, 表明該基因?yàn)榻M成型表達(dá), 并在衰老組織中有較高表達(dá)量。

圖5 SsNAP2a基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中的表達(dá)量Fig. 5 Relative expression pattern of SsNAP2a genes at different growth and development stages

2.6 SsNAP2a基因在不同激素脅迫下的表達(dá)

激素對(duì)于植物葉片衰老具有重要的調(diào)控作用,且NAP亞家族成員參與植物的ABA和ET信號(hào)通路調(diào)控葉片衰老[6,18]。本研究qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明(圖6),SsNAP2a基因在ET和ABA脅迫下呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)表達(dá)。在ET脅迫下,SsNAP2a基因在0～3 h顯著上調(diào)表達(dá), 隨后在3～12 h時(shí)呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì),而在24 h時(shí)又達(dá)到最高值, 為對(duì)照的10.6倍。在ABA脅迫下,SsNAP2a基因在0～6 h呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá), 且6 h表達(dá)量最高, 為對(duì)照的7.0倍, 隨后在6～24 h表達(dá)水平顯著降低。表明SsNAP2a基因能快速響應(yīng)ET和ABA激素脅迫, 可能參與甘蔗葉片衰老相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

圖6 SsNAP2a基因在ET和ABA脅迫下的表達(dá)量Fig. 6 Relative expression pattern of SsNAP2a gene in ET and ABA treatments

2.7 SsNAP2a基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)

NAP亞家族成員不僅參與植株生長(zhǎng)發(fā)育、葉片衰老, 而且廣泛受到多種非生物脅迫(低溫、高溫和干旱)的應(yīng)答[4,17]。qRT-PCR分析結(jié)果表明(圖7), 在4℃低溫脅迫下,SsNAP2a基因表達(dá)量在0～48 h時(shí)逐漸呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)趨勢(shì), 在48 h達(dá)到峰值, 是對(duì)照的31.9倍, 并在48～72 h顯著下調(diào)至對(duì)照的表達(dá)量。在40℃高溫脅迫下,SsNAP2a基因在12 h時(shí)快速響應(yīng)脅迫, 表達(dá)量達(dá)到最高值, 為對(duì)照的33.8倍, 隨后在12～24 h顯著降至對(duì)照的表達(dá)量, 而在48～72 h其表達(dá)量又呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá), 維持在對(duì)照的8.2～8.9倍水平。在PEG-6000脅迫下,SsNAP2a基因呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)趨勢(shì), 在12 h迅速降至最低表達(dá)量, 為對(duì)照的0.6%, 并在12～72 h基本維持低表達(dá)水平。表明SsNAP2a基因受非生物脅迫后能快速響應(yīng)逆境,尤其是對(duì)干旱和高溫逆境脅迫具有較高敏感性。

圖7 SsNAP2a基因在低溫、高溫和干旱脅迫下的表達(dá)量Fig. 7 Relative expression of SsNAP2a gene under low temperature, high temperature, and drought stresses

2.8 SsNAP2a蛋白的亞細(xì)胞定位

pSuper1300-35S::SsNAP2a::GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位(圖8)結(jié)果表明, 注射含有pSuper1300-35S::GFP空白載體農(nóng)桿菌的煙草葉肉細(xì)胞的質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有綠色熒光信號(hào), 而融合載體的蛋白僅在細(xì)胞核中有綠色熒光, 表明SsNAP2a蛋白定位細(xì)胞核, 該結(jié)果與生物信息方法預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。

圖8 SsNAP2a蛋白的亞細(xì)胞定位Fig. 8 Subcellular localization of SsNAP2a protein

2.9 SsNAP2a基因的瞬時(shí)表達(dá)

將含有過(guò)表達(dá)載體pMDC202-35S::SsNAP2a和空載體pMDC202-35S::00農(nóng)桿菌分別注射煙草葉片,并置于黑暗下共培養(yǎng), 于不同時(shí)間觀察表型和DAB染色。從圖9-a可知, 農(nóng)桿菌侵染后1 d, 處理組和對(duì)照組葉片表型和DAB染色結(jié)果沒(méi)有差異, 免疫相關(guān)基因的表達(dá)量也沒(méi)有顯著性差異, 表明沒(méi)有過(guò)氧化氫的產(chǎn)生, 尚未產(chǎn)生免疫相關(guān)反應(yīng)。當(dāng)侵染2 d后,對(duì)照組和處理組的DAB染色都有褐色產(chǎn)生, 但二者差異不大, 該結(jié)果與葉片的表型基本一致, 但SA代謝相關(guān)基因(NtPR1a/c)和ET合成相關(guān)基因(NtAccdeaminase)有顯著性上調(diào)表達(dá), 推測(cè)SsNAP2a基因參與該通路相關(guān)基因反應(yīng)。當(dāng)侵染7 d后, 處理組和對(duì)照組的葉片都開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫和變黃葉緣, 處理組的葉片比對(duì)照組有明顯的卷曲、皺縮凋零表型,DAB染色都發(fā)現(xiàn)褐色加深, 對(duì)照組的顏色比較均勻一致, 而處理組的葉緣部分顏色加深更加明顯。乙烯合成相關(guān)基因(NtEFE26、NtAccdeaminase)顯著上調(diào)表達(dá), 而SA、MeJA和ABA合成相關(guān)基因(NtPR-1a/c、NtPR3和NtAREB1)顯著下調(diào)表達(dá), ABA合成基因與SA和JA合成相關(guān)基因相比, 下降趨勢(shì)較低。而過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量都沒(méi)有發(fā)生顯著性差異。以上瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明, 過(guò)表達(dá)SsNAP2a能引起SA、JA和ABA通路相關(guān)基因表達(dá)而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng), 尤其是誘導(dǎo)乙烯合成通路相關(guān)基因表達(dá),且該通路受SsNAP2a基因影響最為顯著, 而這些激素(ET、ABA、SA和JA)都能加速并促進(jìn)煙草葉片出現(xiàn)衰老表型。

圖9 SsNAP2a基因在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)Fig. 9 Transient expression of SsNAP2a gene in tobacco leaves

3 討論

植物葉片衰老是涉及一系列生理生化指標(biāo)、激素及基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程, 葉綠素含量下降引起葉片黃化是衰老最為明顯特征之一[32,35-36]。NAP亞家族是被認(rèn)為在植物生長(zhǎng)發(fā)育、葉片衰老及激素和非生物脅迫中都有發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6,32]。我們?cè)谇捌谝谚b定和挖掘甘蔗割手密種NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因的基礎(chǔ)上, 運(yùn)用比較基因組學(xué), 對(duì)其NAP亞家族成員進(jìn)行鑒定, 克隆獲得NAP關(guān)鍵候選基因, 初步分析執(zhí)行的生物學(xué)功能, 該研究為甘蔗葉片衰老的分子機(jī)制解析提供一定的研究基礎(chǔ)。NAP亞家族已經(jīng)在擬南芥、水稻、小麥、棉花等植物中鑒定, 成員數(shù)量存在差異[2,9], 比如: 在雙子葉植物中番茄和馬鈴薯有4個(gè)、擬南芥和番木瓜有5個(gè)、葡萄和甜橙有6個(gè)、毛果楊和可可有7個(gè)[9]; 而禾本科的水稻有7個(gè)、二穗短柄草、玉米和高粱都有5個(gè)成員[9]。本研究中, 甘蔗割手密種基因組含有5個(gè)NAP亞家族成員, 表明NAP亞家族成員的數(shù)量在甘蔗與禾本科近緣物種間相差不大。已有研究表明, 作為單子葉植物的菠蘿與禾本科作物共享最近的共同祖先, 二者相比, 菠蘿基因組少了一次全基因組復(fù)制事件(whole genome duplication, WGD)[37],而菠蘿的NAP亞家族僅有3個(gè)成員, 因此, 我們推測(cè)禾本科物種NAP成員發(fā)生擴(kuò)增事件均來(lái)自ρWGD事件。亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果表明, 所有NAP亞家族成員都定位于細(xì)胞核上。本研究還通過(guò)煙草的亞細(xì)胞定位, 揭示SsNAP2a蛋白定位于細(xì)胞核, 該結(jié)果與已報(bào)道NAC轉(zhuǎn)錄因子和其他物種NAP成員的定位結(jié)果一致[18,20,29,32,38]。同時(shí),Ka/Ks比值能判定基因受到的選擇壓力情況, 通過(guò)與近緣物種高粱NAP直系同源基因相比, 所有基因?qū)a/Ks比值都小于1,提示該亞家族成員都受到較強(qiáng)純化選擇壓力, 僅有SsNAP2與SbNAP2的比值為0.654, 大于0.5, 表明該直系同源基因?qū)赡馨l(fā)生功能分化。

甘蔗割手密種是現(xiàn)代甘蔗栽培品種的2個(gè)祖先種之一, 為現(xiàn)代甘蔗雜交的栽培品種貢獻(xiàn)了抗旱、抗寒和抗病等抗逆響應(yīng)關(guān)鍵基因[39], 使得僅適合種植在熱帶地區(qū)的甘蔗熱帶種, 通過(guò)與割手密種雜交后, 其雜種廣泛適應(yīng)熱帶、亞熱帶及部分溫帶地區(qū),極大地?cái)U(kuò)大了甘蔗種植區(qū)域[40]。目前, 甘蔗屬僅有割手密種基因組已經(jīng)被破譯, 分別為基礎(chǔ)染色體數(shù)是X=10和X=8的2個(gè)割手密種基因組[39,41]。而在生產(chǎn)上常用割手密種SES208作為雜交親本, 以提高甘蔗雜交種的抗逆性。本研究從2022年破譯的割手密種NP-X基因組中鑒定NAP亞家族成員, NAP作為NAC家族基因中的一個(gè)亞家族, 除了具有NAC轉(zhuǎn)錄因子的共同特征NAM結(jié)構(gòu)域(A、B、C、D、E亞結(jié)構(gòu)域)外, 也具有NAP亞家族特有的保守序列IFSDx6IYDGG和YQIPGLNWY[2]。結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道的擬南芥、水稻、玉米和棉花的NAP亞家族和本研究鑒定的甘蔗、高粱、菠蘿的NAP亞家族,我們開(kāi)展了系統(tǒng)演化分析, 可以將NAP亞家族分為4個(gè)Clade, 該結(jié)果與范凱[9]分類不同, 可能是聚類方法和參與分類物種和亞家族成員數(shù)目相差較大導(dǎo)致。

前人研究表明, 葡萄VvNAP基因在成熟的花和果實(shí)中高表達(dá), 但在根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官?zèng)]有檢測(cè)到表達(dá)[42]。番紅花CsatNAP基因則在成熟雄蕊和內(nèi)層苞片中較高表達(dá)量[10]。棉花GhNAC8基因子在葉和根中高表達(dá), 在子葉和花藥組織中低表達(dá)[17],GhNAP基因隨著棉花葉齡的衰老而表達(dá)量呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)[43]。范凱[9]發(fā)現(xiàn),NAP基因在所有組織中都有表達(dá), 但不同種棉花種中表達(dá)量有差別, 總體而言, 在較老的子葉中呈現(xiàn)最高表達(dá), 其次是在根中表達(dá), 而莖稈和幼葉的表達(dá)量最低。OsNAP基因也是隨著水稻葉片的變老表達(dá)量逐漸增加趨勢(shì), 尤其灌漿期OsNAP表達(dá)量增加最快[18]。本研究發(fā)現(xiàn),SsNAP2a基因在割手密不同生長(zhǎng)發(fā)育階段都有表達(dá),其中+1葉和根中表達(dá)量最高, 幼嫩組織的表達(dá)量最低, 而上述結(jié)果也都揭示NAP基因都在衰老的組織中表達(dá)量高于幼嫩組織, 該結(jié)果與水稻、棉花結(jié)果基本相似[9,18], 但與葡萄不同[42], 表明NAP基因參與植物花、根、莖和葉組織生長(zhǎng)發(fā)育及衰老過(guò)程。

近年來(lái), 隨著全球氣候變化加劇, 干旱、高溫和低溫等極端非生物因素威脅農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育, 都在不同程度上引起作物的減產(chǎn)、早衰及營(yíng)養(yǎng)成分低等, 已有多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子受到不同非生物脅迫響應(yīng)的報(bào)道[23,44]。在低溫和PEG脅迫下, 屬于棉花NAP的家族成員GhNAC8呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)模式,而GhNAC9僅在PEG脅迫下上調(diào)表達(dá), 而對(duì)低溫脅迫沒(méi)有變化[17];GhNAC5在受到低溫和干旱脅迫后,表達(dá)量呈現(xiàn)顯著上升, 表明NAP亞家族成員響應(yīng)干旱和低溫脅迫應(yīng)答。李捷[38]利用10℃低溫和PEG脅迫水稻幼苗,OsNAP基因受誘導(dǎo)表達(dá)模式, 且過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)對(duì)非生物脅迫的抗性。本研究中, 甘蔗割手密種SsNAP2a基因都能迅速地響應(yīng)低溫、高溫和干旱的脅迫, 除對(duì)干旱脅迫表現(xiàn)顯著下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)外, 對(duì)高溫和低溫都呈現(xiàn)顯著上升后再降低的表達(dá)模式, 這些研究結(jié)果表明NAP家族成員與NAC家族其他亞家族成員一樣, 如ATAF和NAM亞家族[23,45], 都參與并調(diào)控農(nóng)作物對(duì)于低溫、高溫和干旱脅迫。

植物衰老過(guò)程常伴隨著多種外部環(huán)境變化(如:溫度、水分、光照及病原菌)和內(nèi)部環(huán)境變化(各類激素與衰老相關(guān)和轉(zhuǎn)錄因子基因)[35], 其中激素對(duì)其影響最為顯著。脫落酸、乙烯、水楊酸、衰老相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄因子基因互作和表觀調(diào)控的變化等均能引發(fā)植物葉片衰老[35-36]。前人將擬南芥、菜薹、棉花、鷹嘴豆、小花蔓澤蘭和水稻的幼苗噴施ABA處理,都發(fā)現(xiàn)其NAP基因受到不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)[4,18],而鷹嘴豆和蘭蒂植株施用ET處理,NAP基因也受到誘導(dǎo)表達(dá)[46-47]。在本研究中,SsNAP2a基因受ABA和ET脅迫呈現(xiàn)顯著誘導(dǎo)表達(dá), 與ET處理相比,SsNAP2a能快速響應(yīng)ABA脅迫, 隨后呈顯著下調(diào)表達(dá), 但SsNAP2a受到ET的響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(3～24 h)且持續(xù)上調(diào)表達(dá), 其表達(dá)量也高于ABA脅迫, 這可能暗示外源施用ET和ABA均能誘導(dǎo)SsNAP2a表達(dá),進(jìn)而刺激ET和ABA合成途徑相關(guān)基因表達(dá)并調(diào)控植株葉片生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí), 我們將SsNAP2a基因在煙草葉片瞬時(shí)過(guò)表達(dá), 處理組7 d后的葉片衰老表型明顯強(qiáng)于對(duì)照組, 且葉片出現(xiàn)卷曲、枯萎的衰老表型, ET合成相關(guān)基因較早呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)模式, 而JA、SA和ABA途徑相關(guān)基因都呈現(xiàn)顯著下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。該結(jié)果與Carrillo等[20]研究基本一致, 從另一個(gè)角度佐證了甘蔗割手密種SsNAP2a可能主要參與乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑, 誘發(fā)下游相關(guān)基因表達(dá)引發(fā)植株衰老。已有研究表明, 在擬南芥衰老葉片中或ABA脅迫下, 發(fā)現(xiàn)AtNAP和SAG113基因都與葉片衰老呈現(xiàn)正相關(guān)性, 且SAG113在衰老葉片保衛(wèi)細(xì)胞中高表達(dá), 并調(diào)控的氣孔運(yùn)動(dòng)和水分流失[48]。Zhang等[49]通過(guò)酵母單雜交(One-hybrid system, Y1H)和電泳遷移率(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SAG113是AtNAP的靶標(biāo)基因, 并提出ABA-AtNAP-SAG113的衰老調(diào)控模式, 而Fan等[43]研究棉花GhNAP基因也受到ABA介導(dǎo)的葉片衰老, 但不直接調(diào)控SAG113表達(dá)。過(guò)表達(dá)OsNAP可顯著促進(jìn)水稻衰老, 而敲除OsNAP產(chǎn)生了明顯的衰老延遲,OsNAP在ABA合成突變體aba1和aba2中均被抑制表達(dá), 而在osnap突變體中, ABA含量顯著降低, 該結(jié)果表明ABA不僅能誘導(dǎo)OsNAP表達(dá),而且OsNAP表達(dá)量受到ABA生物合成途徑的反饋抑制[18]。上述結(jié)果表明, 在不同物種中, ABA調(diào)控NAP基因引發(fā)植株葉片衰老的結(jié)果基本一致, 但我們的研究還顯示, 除了ABA參與調(diào)控植株葉片衰老外, ET也是一種能夠?qū)χ仓耆~片衰老也起到重要作用的激素。后續(xù)研究中, 我們擬將SsNAP2a基因轉(zhuǎn)化模式作物水稻及osnap突變體中, 測(cè)定ABA和ET含量, 再利用酵母單雜交驗(yàn)證其與甘蔗SAG113的調(diào)控關(guān)系, 進(jìn)一步完善激素調(diào)控NAP基因引發(fā)葉片衰老分子機(jī)制, 最終為甘蔗抗衰老分子育種研究奠定理論基礎(chǔ)和候選基因資源。

4 結(jié)論

本研究先首先鑒定了5個(gè)甘蔗割手密種NAP亞家族成員, 結(jié)合已報(bào)道代表性物種NAP亞家族成員,將其分為4個(gè)Clade; 從該亞家族成員啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)多個(gè)激素、低溫等逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件。其次, 克隆SsNAP2成員的等位基因SsNAP2a。qRT-PCR表明SsNAP2a基因在割手密種不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中為組成型表達(dá), 而在衰老的蔗皮和根中表達(dá)量最高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),SsNAP2a基因在乙烯、脫落酸、4℃低溫和40℃高溫處理下被誘導(dǎo)表達(dá), 而在聚乙二醇脅迫下表達(dá)量下調(diào), 表明該基因可以響應(yīng)激素和非生物脅迫。最后, 瞬時(shí)過(guò)表達(dá)SsNAP2a基因7 d后本氏煙葉片有明顯的卷曲、皺縮等衰老表型, ET合成相關(guān)基因顯著上調(diào)表達(dá), 而水楊酸、茉莉酸和ABA合成相關(guān)基因顯著下調(diào)表達(dá), 表明SsNAP2a基因可能參與多種激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘發(fā)甘蔗葉片衰老。以上結(jié)果為深入探究甘蔗NAP亞家族基因成員參與調(diào)控葉片衰老的分子機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。