[摘 " 要] " 目的：探討缺氧和鐵死亡相關(guān)基因?qū)Ψ蜗侔┑念A(yù)后價值，構(gòu)建預(yù)測肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）患者預(yù)后的列線圖模型。方法：從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫識別缺氧和鐵死亡相關(guān)肺腺癌預(yù)后差異表達基因，利用LASSO-Cox回歸構(gòu)建基因風(fēng)險評分系統(tǒng)，進一步構(gòu)建肺腺癌預(yù)后模型，分別使用校準(zhǔn)曲線、受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析、決策曲線分析評價其預(yù)測效果。采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）檢測LUAD與癌旁組織中風(fēng)險差異基因的表達水平。結(jié)果：成功構(gòu)建了8基因風(fēng)險評分系統(tǒng)，建立了可有效預(yù)測LUAD患者預(yù)后的列線圖模型，具有良好的預(yù)測效果。LUAD組織中核心蛋白聚糖（decorin，DCN）和血小板衍生生長因子 B 亞基（platelet derived growth dactor subunit B，PDGFB）明顯下調(diào)，二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、巨噬細胞移型抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）、核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2）和溶質(zhì)載體家族2（solute carrier family 2 member 1，SLC2A1）明顯上調(diào)（均P＜0.05）。結(jié)論：本研究構(gòu)建的預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的列線圖模型可為個性化治療提供參考。

[關(guān)鍵詞] " 肺腺癌；缺氧；鐵死亡；預(yù)后模型

[中圖分類號] " R734.2 [文獻標(biāo)志碼] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.001

Construction of a Prognostic Model for Lung Adenocarcinoma Based

on Hypoxia- and Ferroptosis-Related Genes

WU Meng1， WANG Hongbing2

（1Department of Tumor Chemotherapy， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001;

2Department of Medical Oncology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University）

[Abstract] " Objective： To explore the prognostic value of hypoxia- and ferroptosis-related genes in lung adenocarcinoma （LUAD） and construct a nomogram model for predicting the prognosis of patients with LUAD. Methods： Hypoxia- and ferroptosis-related differentially expressed genes in lung adenocarcinoma were identified from the cancer genome atlas （TCGA） database. A gene risk scoring system was constructed "using LASSO-Cox regression， followed by the construction of a prognostic model for lung adenocarcinoma. The predictive effect of the model was evaluated through calibration curve， receiver operating characteristic （ROC） curve， and decision curve analysis. Quantitative reverse transcription PCR （RT-qPCR） was used to verify the differential expression of risk genes between LUAD tissues and the adjacent normal tissues. Results： An eight-gene risk scoring system and a nomogram model for predicting the prognosis of LUAD patients were constructed， demonstrating good predictive effect. The expression of decorin （DCN） and platelet derived growth factor subunit B （PDGFB） decreased obviously， and the expression of dipeptidyl peptidase 4 （DPP4）， macrophage migration inhibitory factor （MIF）， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）， lactate dehydrogenase A （LDHA）， ribonucleotide reductase regulatory subunit M2 （RRM2）， and solute carrier family 2 member 1（SLC2A1） increased significantly （Plt;0.05）. Conclusion： This nomogram model for predicting the prognosis of lung adenocarcinoma patients constructed in this study can provide reference for personalized treatment.

[Key words] " lung adenocarcinoma; hypoxia; ferroptosis; prognostic model

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）約占肺癌的65%[1]。隨著疾病篩查及診療手段的提高，患者生存時間得到一定延長，但總體預(yù)后不容樂觀。臨床上常根據(jù)腫瘤分期及單基因預(yù)測患者預(yù)后，制定治療方案，但往往與實際情況相差較大。由于腫瘤快速、不受控制增殖，導(dǎo)致耗氧與供氧的失衡，缺氧是實體瘤微環(huán)境的典型特征之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可能提高腫瘤的侵襲性，并導(dǎo)致對治療的抵抗[2]。另外，鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的鐵依賴的由脂質(zhì)過氧化和活性氧積累引起的程序性細胞死亡形式[3]。相關(guān)研究表明，缺氧與鐵死亡存在一定的聯(lián)系，F(xiàn)UHRMANN等[4]發(fā)現(xiàn)缺氧抑制鐵蛋白吞噬作用，從而增加線粒體鐵蛋白，防止鐵死亡的發(fā)生；YANG等[5]發(fā)現(xiàn)，腫瘤缺氧微環(huán)境以缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）依賴的方式促進實體瘤對鐵死亡的抵抗。HIF-1α與在缺氧下促進腫瘤鐵死亡的HIF-2α結(jié)合可能是缺氧誘導(dǎo)鐵死亡抵抗的主要驅(qū)動因素。本研究旨在探討缺氧聯(lián)合鐵死亡相關(guān)基因在LUAD中的預(yù)后價值，構(gòu)建預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的列線圖模型。

1 " 資料與方法

1.1 " 資料來源 " 本研究共納入3個獨立隊列，包括1個癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）隊列（n=509）和2個基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene erpression omnibus，GEO）隊列：GSE 68465（n=442）和GSE 72094（n=398）。將TCGA隊列作為訓(xùn)練集，GEO隊列作為外部驗證集。其中GSE 68465數(shù)據(jù)集僅涉及是否化療，并未詳細描述具體化療方案，而GSE 72094未公布任何治療相關(guān)信息，因此本研究模型構(gòu)建未納入腫瘤治療相關(guān)信息。

1.2 " 風(fēng)險評分系統(tǒng)的構(gòu)建和驗證 " 在TCGA隊列中，使用R語言“l(fā)imma”包識別缺氧和鐵死亡相關(guān)差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），閾值設(shè)置為Log2（差異倍數(shù)）gt;1且偽發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）lt;0.05。采用單因素Cox回歸分析篩選預(yù)后基因。利用LASSO-Cox回歸分析在TCGA隊列中選擇具有較高預(yù)后價值的DEGs，構(gòu)建風(fēng)險評分系統(tǒng)。根據(jù)各基因歸一化表達水平及其對應(yīng)的回歸系數(shù)計算患者的風(fēng)險評分，風(fēng)險評分=各基因表達量×對應(yīng)系數(shù)。根據(jù)風(fēng)險評分中位數(shù)，將納入患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。使用R語言“survival”和“survminer”包進行Kaplan-Meier生存分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估風(fēng)險評分系統(tǒng)的預(yù)測能力。以同樣的分析方法在2個GEO隊列（外部驗證集）中驗證風(fēng)險評分系統(tǒng)的穩(wěn)健性。通過Cox回歸分析檢驗風(fēng)險評分是否可以作為LUAD獨立預(yù)后標(biāo)志。

1.3 " 列線圖預(yù)后模型的構(gòu)建和驗證 " 基于多因素Cox回歸分析中的獨立風(fēng)險因素，構(gòu)建個體化預(yù)測LUAD患者1年、2年及3年生存概率的列線圖模型，通過校準(zhǔn)曲線、ROC曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）、決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評估模型的準(zhǔn)確性和臨床應(yīng)用價值。

1.4 " 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR） " 經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審核同意，患者簽署知情同意書，收集徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)治療的20例LUAD患者的新鮮腫瘤組織和配對癌旁組織標(biāo)本，每份標(biāo)本50～100 mg，采用RT-qPCR檢測組織中風(fēng)險差異基因的表達水平。

1.5 " 統(tǒng)計學(xué)處理 " 使用R軟件（4.0.3版）進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。腫瘤組織與癌旁正常組織間基因表達水平比較采用t檢驗。通過對數(shù)秩檢驗（Mantel-Cox）和Kaplan-Meier（KM）生存分析比較兩個風(fēng)險組的生存時間。使用單因素和多因素Cox回歸模型篩選預(yù)后相關(guān)因素。分別使用校準(zhǔn)曲線、ROC曲線、DCA分析評價其預(yù)測效果。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 " 結(jié) " " "果

2.1 " 3個獨立隊列LUAD患者臨床特征 " 見表1。

2.2 " 缺氧和鐵死亡相關(guān)預(yù)后DEGs的識別 " 在TCGA隊列中，識別出59個與缺氧和鐵死亡相關(guān)的DEGs和76個預(yù)后相關(guān)基因，兩者交集后得到預(yù)后DEGs，經(jīng)癌癥和正?；虮磉_譜分析及交互分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（web server for cancer and normal gene expression profiling and interaction analysis，GEPIA）及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫驗證，確認17個缺氧和鐵死亡相關(guān)預(yù)后DEGs。見圖1。

2.3 " 風(fēng)險評分系統(tǒng)的構(gòu)建 " LASSO-Cox回歸分析得到8基因風(fēng)險評分系統(tǒng)：0.067×GAPDH+0.349×LDHA+0.002×MIF+0.153×PDGFB+0.088×RRM2+0.002×SLC2A1-0.046×DCN-0.007×DPP4（基因表達值）。

2.4 " 風(fēng)險評分系統(tǒng)預(yù)測性能驗證 " TCGA隊列中，低風(fēng)險組患者生存時間明顯長于高風(fēng)險組患者，ROC曲線1年、2年和3年AUC分別為0.677、0.701和0.712。風(fēng)險評分和生存時間分布情況顯示，高風(fēng)險組生存時間普遍較低風(fēng)險組短，與Kaplan-Meier生存分析結(jié)果一致。主成分分析（principal component analysis，PCA）和t分布隨機鄰近嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）分析表明，風(fēng)險評分可很好區(qū)分高低風(fēng)險。對GSE 68465隊列中442例患者使用與TCGA隊列相同的公式計算風(fēng)險評分值，獲得的結(jié)果與TCGA隊列相似，ROC曲線1、2和3年AUC分別為0.715、0.694和0.681。對GSE 72094隊列中398例患者使用與TCGA隊列相同的公式計算風(fēng)險評分值，與TCGA 隊列、GSE 68465隊列的結(jié)果相似，ROC曲線1、2和3年AUC值分別為0.674、0.664和0.635。

2.5 " 風(fēng)險評分系統(tǒng)獨立預(yù)后價值 " 單因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險評分對總生存率（overall survival，OS）的影響有統(tǒng)計學(xué)意義（HR=3.832，95%CI=2.550～5.758，Plt;0.001）。在GSE 68465隊列（HR=3.985，95%CI=2.252～7.050，Plt;0.001）和GSE 72094隊列（HR=6.577，95%CI=3.094～13.983，Plt;0.001）中驗證，獲得相同的結(jié)果。在TCGA隊列中，多因素Cox 回歸分析仍然證明風(fēng)險評分是OS的獨立影響因素（HR=3.443，95%CI=2.263～5.238，Plt;0.001）。同樣，該結(jié)果在GSE 68465隊列（HR=3.969，95%CI=2.241～7.030，Plt;0.001）和GSE 72094隊列（HR=4.894，95%CI=2.262～10.591，Plt;0.001）中得到驗證。

2.6 " 構(gòu)建預(yù)測LUAD患者生存情況的列線圖模型 " 為了將8基因特征風(fēng)險評分的預(yù)后價值轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，基于多因素Cox回歸分析中的獨立風(fēng)險因素（包括風(fēng)險評分及TNM分期），構(gòu)建一個可以預(yù)測LUAD患者1年、2年及3年生存概率的列線圖模型（圖2）。讀取列線圖時需向上畫垂直線即可得到各風(fēng)險因素對應(yīng)的分值，把兩項分值相加并在總分刻度尺上標(biāo)記其對應(yīng)的位置，向下畫垂線即可分別得到1年、2年和3年的生存概率。

2.7 " 列線圖模型的驗證 " 校準(zhǔn)曲線分別比較1年、2年和3年列線圖模型預(yù)測生存概率與Kaplan-Meier分析得到的實際生存概率，結(jié)果顯示，預(yù)測生存概率與實際生存概率高度一致，說明本模型準(zhǔn)確度高。列線圖模型ROC曲線顯示1年、2年、3年的AUC值分別為0.703、0.735和0.748，表明本模型預(yù)測性較好，區(qū)分度高，具有良好的預(yù)測價值。DCA分析表明列線圖模型即TNM分期聯(lián)合基因模型在更大的閾概率范圍內(nèi)獲得了較兩者單獨應(yīng)用更高的凈收益率，為患者帶來更大獲益，見圖3。

2.8 " 實驗驗證 " RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織，LUAD組織中DCN和PDGFB基因明顯下調(diào)，DPP4、MIF、GAPDH、LDHA、RRM2和SLC2A1基因明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3 " 討 " " "論

缺氧和鐵死亡在腫瘤發(fā)展中起著重要作用[6]，缺氧通過誘導(dǎo)多種信號通路促進癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡形式，主要通過鐵依賴性脂質(zhì)過氧化來執(zhí)行，可能作為肺癌潛在的治療靶點[8-9]。本研究構(gòu)建基于缺氧和鐵死亡相關(guān)基因的肺腺癌預(yù)后列線圖模型，顯示出良好的預(yù)測性能，可有效地區(qū)分高風(fēng)險和低風(fēng)險患者，通過驗證集進一步證明模型的穩(wěn)健性。本模型不僅可以為臨床醫(yī)生提供有價值的預(yù)后信息，還有助于制定個性化的治療策略，針對缺氧和鐵死亡途徑的靶向治療可能為高風(fēng)險患者提供新的治療選擇。

盡管本模型在驗證集中表現(xiàn)良好，但仍存在一些局限性。首先，本研究主要基于公開數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，可能存在選擇偏倚。其次，在臨床實踐中常以TNM分期作為預(yù)后及后續(xù)治療的重要參考因素，本研究雖納入TNM分期構(gòu)建模型，但獲取的數(shù)據(jù)有限，也未納入治療相關(guān)信息。未來應(yīng)開展大規(guī)模的多中心大樣本臨床研究以及深入的分子機制研究，進一步驗證和完善預(yù)后模型。

總之，本研究成功構(gòu)建了新的8基因風(fēng)險評分系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上建立了可有效預(yù)測LUAD患者預(yù)后的列線圖模型，為患者個性化治療提供參考。

[參考文獻]

[1] 邱海波，曹素梅，徐瑞華. 基于2020年全球流行病學(xué)數(shù)據(jù)分析中國癌癥發(fā)病率、死亡率和負擔(dān)的時間趨勢及與美國和英國數(shù)據(jù)的比較［J］. 癌癥，2022，41（4）：165-177.

[2] SALEM A，ASSELIN M C，REYMEN B，et al. Targeting hypoxia to improve non-small cell lung cancer outcome［J］. J Natl Cancer Inst，2018，110（1）：4096546.

[3] LIANG D，MINIKES A M，JIANG X. Ferroptosis at the intersection of lipid metabolism and cellular signaling［J］. Mol Cell，2022，82（12）：2215-2227.

[4] FUHRMANN D C，MONDORF A，BEIFU？覻 J，et al. Hypoxia inhibits ferritinophagy，increases mitochondrial ferritin，and protects from ferroptosis［J］. Redox Biol，2020，36：101670.

[5] YANG Z，SU W，WEI X，et al. HIF-1α drives resistance to ferroptosis in solid tumors by promoting lactate production and activating SLC1A1［J］. Cell Rep，2023，42（8）：112945.

[6] 高純一，吳新賀，姜正林，等. 微環(huán)境下腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化對乳腺癌進展作用［J］. 交通醫(yī)學(xué)，2018，32（3）：205-211，217.

[7] FAN P，ZHANG N，CANDI E，et al. Alleviating hypoxia to improve cancer immunotherapy［J］. Oncogene，2023，42（49）：3591-3604.

[8] DOS SANTOS A F，F(xiàn)AZELI G，XAVIER DA SILVA T N，et al. Ferroptosis： mechanisms and implications for cancer development and therapy response［J］. Trends Cell Biol，2023，

33（12）：1062-1076.

[9] CHEN Z，WANG W，ABDUL RAZAK S R，et al. Ferroptosis as a potential target for cancer therapy［J］. Cell Death Dis，2023，14（7）：460.

[收稿日期] 2024-11-12

（本文編輯 " 王曉蘊）