崔云會(huì)

河南省商丘市第一人民醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室 476000

支氣管哮喘作為威脅全球范圍內(nèi)的一種嚴(yán)重公眾健康慢性呼吸道疾病,目前以兒童發(fā)病率最高,根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),兒童哮喘患病率為3.3%～29.0%,且患病率總體上仍在上升[1]。雖目前關(guān)于該疾病具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,但氣道炎癥在支氣管哮喘發(fā)病中起關(guān)鍵作用[2]。MicroRNA作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的單鏈非編碼小分子RNA,目前研究發(fā)現(xiàn)其參與多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[3]。近年來(lái)已有研究發(fā)現(xiàn)miRNA與哮喘氣道炎癥關(guān)系密切,其可通過(guò)基因水平調(diào)控哮喘發(fā)生發(fā)展[4]。既往有研究顯示,血清miR-30a與極低體重兒支氣管肺發(fā)育不良相關(guān)[5]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),miR-15b-5p可作為哮喘—慢性阻塞性肺病重疊的生物標(biāo)志物[6]。但目前研究關(guān)于外周血miR-30a、miR-15b-5p與支氣管哮喘患兒的關(guān)系尚不清楚。因此,本研究擬分析支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平與氣道炎癥、肺功能的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2020年3月—2022年3月我院收治的123例支氣管哮喘患兒納入研究組,其中男66例,女57例,年齡2～14歲,平均年齡(7.85±1.22)歲。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②均簽署知情同意書;③年齡2～15歲者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①伴有重要臟器功能不全者;②合并感染性疾病、心血管疾病、急慢性感染疾病以及惡性腫瘤疾病者;③既往伴有哮喘病史、其他過(guò)敏性疾病家族史及其他免疫性疾病者;④近期存在免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等治療史者;⑤近期上呼吸道感染史者;⑥臨床資料不全者;⑦不配合治療、中途退出研究者。另外選擇同期在我院體檢的100例健康兒童作為對(duì)照組,其中男60例,女40例,年齡3～15歲,平均年齡(8.10±1.52)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法 (1)外周血miR-30a、miR-15b-5p檢測(cè):獲得本研究納入對(duì)象同意后,抽取入院24h內(nèi)的空腹外周靜脈血5ml送檢,室溫下以3 500r/min離心15min后取清液,存放至-80℃冰箱內(nèi)備用。取出血清樣本后按照比例加入提取試劑Trizol后充分搖勻,隨后參照miRNA試劑盒提取血清總miRNA。再使用RNA逆轉(zhuǎn)錄盒合成cDNA,反應(yīng)體系15μl,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃15min,85℃5s。利用分光光度計(jì)檢測(cè)cDNA濃度,將cDNA稀釋后取2μl作為模板,采用7500型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)檢測(cè),并以U6作為內(nèi)參照。PCR儀器設(shè)置參數(shù)為95℃、5min、40個(gè)循環(huán),95℃、10s、40個(gè)循環(huán),90℃、1min、40個(gè)循環(huán);miR-30a引物,正向:5’-CATGGGTTGTCTCAGTGTCAGAGCT-3’,反向:5’-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3’,引物長(zhǎng)度235bp;miR-15b-5p引物,正向:5’-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3’,反向:5’-TCTCAGATGGTGAGCGAG-3’,引物長(zhǎng)度176bp。最后采用CFXmanager3.0軟件對(duì)Cq值進(jìn)行分析,再通過(guò)2-Δt法(Δt=CTmiRNA-CTU6)計(jì)算血清miR-30a、miR-15b-5p的相對(duì)表達(dá)量。本研究所有試劑盒均由博士德生物有限公司生產(chǎn)。(2)氣道炎性細(xì)胞檢測(cè):獲得本研究納入對(duì)象同意后收集咳出痰液送檢,觀察記錄各組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)目。(3)肺功能指標(biāo)檢測(cè):由受過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)者采用MasterScreen肺功能檢測(cè)儀測(cè)定所有受試者用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1%)、第1秒用力呼氣量占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)等肺功能指標(biāo),每位受試者均測(cè)定2次,最終結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR-30a、miR-15b-5p水平比較 研究組患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均高于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩組外周血miR-30a、miR-15b-5p水平比較

2.2 兩組氣道炎性細(xì)胞檢測(cè)比較 研究組患兒誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目均高于對(duì)照組(P<0.05),巨噬細(xì)胞的數(shù)目低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 兩組氣道炎性細(xì)胞檢測(cè)比較

2.3 兩組肺功能指標(biāo)比較 研究組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指標(biāo)均低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 兩組肺功能指標(biāo)比較

2.4 支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p與氣道炎癥、肺功能的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示,支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水

平均與肺功能指標(biāo)(FEV1、FVC、FEV1/FVC)及巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),與細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表4。

2.5 外周血miR-30a、miR-15b-5p對(duì)小兒支氣管哮喘的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析顯示,外周血miR-30a、miR-15b-5p預(yù)測(cè)小兒支氣管哮喘發(fā)生的曲線下面積為0.841(95%CI:0.792～0.890)、0.862(95%CI:0.817～0.917),二者聯(lián)合預(yù)測(cè)小兒支氣管哮喘發(fā)生的曲線下面積為0.911(95%CI:0.874～0.958),見(jiàn)表5、圖1。

圖1 外周血miR-30a、miR-15b-5p對(duì)小兒支氣管哮喘的預(yù)測(cè)ROC曲線

表5 外周血miR-30a、miR-15b-5p對(duì)小兒支氣管哮喘的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

miRNA作為由21～25個(gè)核苷酸組成,有著超強(qiáng)的穩(wěn)定性的非編碼單鏈RNA分子,參與細(xì)胞分化、基因調(diào)控、腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)功能,目前已經(jīng)被公認(rèn)為是生物體內(nèi)的重要調(diào)控分子[8-9]。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA中的miR-145-5p、RNAmiR-21等均可通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等影響支氣管哮喘的病理生理過(guò)程[10-11]。而miR-30a、miR-15b-5p雖也作為miRNA成員之一,但李智慧等[12]miR-30a通過(guò)靶向調(diào)控E盒結(jié)合鋅指蛋白2抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移與侵襲;但叢鵬等[13]研究顯示,肝細(xì)胞癌患者血清miR-30a表達(dá)水平低于正常人群。Ma等[14]研究發(fā)現(xiàn),miR-15b-5p可抑制STAT3表達(dá)從而減輕2型糖尿病相關(guān)肺結(jié)核小鼠的肺損傷;Salimi等[15]研究顯示,miR-15b-5p在外界毒物致肺損傷過(guò)程中明顯升高。

本研究分析外周血miR-30a、miR-15b-5p水平在支氣管哮喘患兒中發(fā)現(xiàn),研究組患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均高于對(duì)照組(P<0.05),提示外周血miR-30a、miR-15b-5p水平可能參與支氣管哮喘的發(fā)生,與以上某些研究結(jié)論一致。嗜酸粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞都是目前常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞,而本次研究分析結(jié)果顯示,研究組患兒誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的數(shù)目均高于對(duì)照組,巨噬細(xì)胞的數(shù)目低于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明支氣管哮喘患兒誘導(dǎo)痰液中的炎癥細(xì)胞數(shù)目顯著增多,進(jìn)一步提示患兒氣道存在明顯的炎癥反應(yīng)。

同時(shí)本研究結(jié)果顯示,研究組患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC肺功能指標(biāo)均低于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明支氣管哮喘患兒存在肺部氣流受限。本研究相關(guān)分析顯示,支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均與肺功能指標(biāo)(FEV1、FVC、FEV1/FVC)及巨噬細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),與細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)(P<0.05),說(shuō)明miR-30a、miR-15b-5p與支氣管哮喘患兒氣道炎癥及氣流受限關(guān)系密切,且外周血miR-30a、miR-15b-5p水平升高可能導(dǎo)致患兒發(fā)生氣道炎癥反應(yīng)及呼氣氣流受限,進(jìn)而加重疾病進(jìn)展。本研究ROC曲線分析顯示,外周血miR-30a、miR-15b-5p預(yù)測(cè)小兒支氣管哮喘發(fā)生的曲線下面積為0.841、0.862,說(shuō)明外周血miR-30a、miR-15b-5p均對(duì)小兒支氣管哮喘的發(fā)生有著良好的預(yù)測(cè)價(jià)值,且其水平超過(guò)截?cái)嘀?提示存在支氣管哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

相關(guān)研究報(bào)道,支氣管哮喘發(fā)作與氣道炎癥、變態(tài)反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性等相互作用有關(guān)[16]。既往研究顯示,外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p高表達(dá)可使膿毒癥患者促炎因子表達(dá)上調(diào),抗炎因子表達(dá)受到抑制[17],而血清miR-30a也與膿毒癥病情嚴(yán)重程度有關(guān)[18]。而既往研究涉及更多的是miR-15b-5p調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡的功能,但有研究發(fā)現(xiàn),血清miR-15相對(duì)表達(dá)量參與潰瘍性結(jié)腸炎患者炎性反應(yīng)狀態(tài)[19]。因此本研究推測(cè),外周血miR-30a、miR-15b-5p水平升高可機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng),因此有可能導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)生。另外研究發(fā)現(xiàn),外周血miR-30a聯(lián)合miR-15b-5p預(yù)測(cè)小兒支氣管哮喘發(fā)生的曲線下面積高于單一指標(biāo),說(shuō)明二者聯(lián)合應(yīng)用更有助于診斷小兒支氣管哮喘發(fā)生,從而可為臨床及時(shí)采取積極有效的治療干預(yù)措施提供依據(jù)。

綜上所述,支氣管哮喘患兒外周血miR-30a、miR-15b-5p水平均呈高表達(dá),且水平變化與氣道炎癥、肺功能密切相關(guān),另外可作為預(yù)測(cè)支氣管哮喘患兒發(fā)病的有效指標(biāo)。但本研究為單中心樣本分析,可能存在選擇偏倚,因此后續(xù)研究中將擴(kuò)大樣本來(lái)源單位進(jìn)一步分析。