摘要：為獲得防治煙草黑脛病的生防資源，采用稀釋涂布法及室內平板對峙法從煙草根際分離篩選煙草疫霉Phytophthora nicotianae）生防菌株。通過形態(tài)學、生理生化特性和16S rDNA 序列分析進行鑒定，并明確其抑菌廣譜性及促生特性。篩選獲得一株對煙草疫霉拮抗效果較好的生防細菌M10-4，抑菌率為73.97%，鑒定為吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia），它對辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病菌、煙草靶斑病菌都有一定抑制效果，對煙草黑脛病的田間防效為60.7%。該生防菌株具有產(chǎn)IAA能力，產(chǎn)IAA達6.754 mg/L，具有溶鉀、溶磷、產(chǎn)蛋白酶的能力，對煙草的株高、最大葉長、總鮮重、總干重、地上部干重等促生效果明顯。吡咯伯克霍爾德氏菌M10-4在病害防控和促生作用上效果明顯，可作為PGPR進行研究，具有較好的應用前景。

關鍵詞：煙草；疫霉；吡咯伯克霍爾德氏菌；生物防治；促生作用

中圖分類號：S435.72" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）24-0133-08

收稿日期：2023-12-13

基金項目：湖南省重點研發(fā)項目（編號：2023NK2019）；中國煙草總公司項目［編號：110202101050（LS-10）、110202201019（LS-03）］。

作者簡介：梅斯釔（1998—），女，江西九江人，碩士，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：453516175@qq.com。

通信作者：唐前君，博士，教授，主要從事植物病害生物防治研究，E-mail：Tangqianjun@126.com；劉天波，高級農(nóng)藝師，主要從事植物病害生物防治研究，E-mail：tianboliu@126.com。

由煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的煙草黑脛病是煙草上一種重要土傳病害，在世界煙區(qū)普遍發(fā)生^［1］，給我國煙草種植業(yè)造成重大損失^［2］。目前，控制煙草黑脛病的主要方法有品種遺傳改良、物理防治、化學防治和生物防治等?；瘜W防治具有簡便性、高效性，是煙草黑脛病首選的防治方法^［3］，但過于依賴化學殺菌劑，不僅使病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會破壞生態(tài)環(huán)境，造成農(nóng)藥殘留、土壤板結、影響非靶標生物生存等問題^［4］。

近年來，為了減少化學殺菌劑的使用，環(huán)境安全友好、無毒無殘留的生物防治手段越來越受到研究者們的關注^［5］。張蒙蒙等在病株根際分離的貝萊斯芽孢桿菌YCYM-09菌株對煙草黑脛病的室內防效為61.5%^［6］。李苗苗等研究發(fā)現(xiàn)，3種芽孢桿菌GY1、GY10、GY12混合施用對煙草疫霉的平板抑菌率為86.9%，盆栽防效為74.53%^［7］。章舸從根際土壤中篩選得到的放線菌H-3對煙草疫霉的抑菌率達81.90%^［8］。生防菌除了可以防治病害，還能促進植物生長發(fā)育，可以作為微生物肥料使用^［9］。吳風光等發(fā)現(xiàn)，用芽孢桿菌A03制成的菌肥對煙草角斑病、赤星病有較好拮抗作用，能提高土壤中的礦質元素含量，從而使烤煙增產(chǎn)^［10］。王典等發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉CGMCC23294在田間對煙草黑脛病防治效果最高達83.6%，同時促進煙株根系發(fā)育和莖葉生長，上等煙比例提高^［11］。目前對防治煙草黑脛病的生防菌篩選主要集中在芽孢桿菌、放線菌等，但由于煙葉種植制度和土壤生態(tài)環(huán)境的差異，需要不斷挖掘和發(fā)現(xiàn)新的本地土著生防菌。目前，對伯克霍爾德氏菌（Burkholderia sp.）作為煙草黑脛病生防菌的研究鮮有報道，研究其防效及促生作用，對豐富煙草病害生防菌株種類和開發(fā)生物菌劑具有重要意義。

本研究從煙草根際土壤中分離篩選出1株對煙草黑脛病有拮抗作用的生防細菌，開展了形態(tài)學、生理生化特征和分子生物學鑒定，測定抑菌譜以及促生特性，以期為豐富生防資源及煙草黑脛病的生物防治提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 煙草疫霉及抑菌譜測定用的辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草鐮刀菌根腐病菌（Fusarium falciforme）、柑橘炭疽病菌（Gloeosporium frucrigenum）、煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）均保存于湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院農(nóng)業(yè)微生物基因組學研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g（固體LB培養(yǎng)基只需在液體LB的基礎上加入15 g瓊脂粉）。馬鈴薯瓊脂固體培養(yǎng)基PDA（1 L）：去皮新鮮馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g。燕麥培養(yǎng)基（1 L）：燕麥片30 g，瓊脂粉15 g。Salkowski比色液^［12］：15 mL濃硫酸中加入25 mL超純水，加入0.75 mL的0.5 mol/L FeCl3·6H2O。

1.2 煙草黑脛病生防菌的分離篩選

采用稀釋涂布法分離菌株^［13］。取黑脛病發(fā)生嚴重的煙田中健康植株的根際土壤，將取得的煙草根際土壤除雜過篩，稱取10 g于250 mL錐形瓶中，無菌水定容至90 mL，置于30" ℃、180 r/min的搖床中充分振蕩混勻20～30 min。將土壤懸浮液稀釋成10^-2～10^-6 5個稀釋倍數(shù)的菌懸液。在超凈臺中用移液器吸取各梯度的土壤溶液0.1 mL至LB平板上涂布，各稀釋設置3個重復，28 ℃恒溫培養(yǎng)。2 d后觀察菌落生長情況，挑取菌落特征不同的單菌落多次平板劃線純化，甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

采用平板對峙法篩選生防菌株^［14］。將培養(yǎng)5 d的煙草疫霉PDA平板用打孔器（直徑5 mm）打取菌餅，作為靶標菌放置在新的PDA平板中央，用無菌吸頭將分離的菌株發(fā)酵液對稱點接在距煙草疫霉菌餅2 cm處，以未接菌株的為空白對照，每個處理3次重復。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置暗培養(yǎng)5～7 d，待對照黑脛病菌絲長滿平板，測量處理菌落直徑，并計算抑菌率。按以下公式計算抑菌率^［15］：

抑菌率=對照組菌落生長直徑-處理組菌落生長直徑對照組菌落生長直徑-菌餅直徑×100%。

1.3 菌株M10-4鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定 將菌株M10-4劃線于固體LB平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落大小、形態(tài)、顏色、光滑程度等特征。挑取單菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察顏色，電鏡觀察芽孢、莢膜、鞭毛等菌體特征。用購于北京奧萊博科技有限公司的芽孢染色液（Moeller法）試劑盒、莢膜染色液（Hiss法）試劑盒、鞭毛染色液（Leifson法）試劑盒進行染色驗證。

1.3.2 生理生化鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》^［16］和《伯杰細菌鑒定手冊》^［17］進行生理生化特性測定。

1.3.3 分子鑒定 挑取菌株M10-4單菌落到 10 μL 無菌水中，重懸混勻，利用細菌擴增通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行擴增。PCR擴增體系（20 μL）為Mix 10 μL、ddH2O 8.2 μL、引物1492R 0.4 μL、引物27F 0.4 μL、模板DNA" 1 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因序列測定，將所測得的序列在NCBI上進行BLAST比對。以大腸桿菌為外群，利用MAGAX軟件，采用Neighbor-Joining法構建拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株M10-4抑菌譜測定

采用平板對峙法分別將辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草鐮刀菌根腐病菌（Fusarium falciforme）、柑橘炭疽病菌（Gloeosporium frucrigenum）、煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）與M10-4對峙培養(yǎng)，操作及抑菌率計算方法同“1.2”節(jié)。

1.5 菌株M10-4發(fā)酵濾液對煙草疫霉的抑制效果

將生防菌接入液體LB中發(fā)酵48 h后分裝到50 mL離心管中，7 000 r/min離心15 min，用 0.22 μm 的過濾器過濾后加入55 ℃左右的燕麥培養(yǎng)基中，搖勻后倒板。配成濾液濃度為10%、30%的平板，以不加濾液的平板為空白對照，每組3個重復。在平板中央接入5 mm煙草疫霉菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，待空白對照長滿后，采用十字交叉法測量處理組菌落直徑，挑取菌絲在光學顯微鏡下觀察形態(tài)^［18］。

1.6 菌株M10-4對煙草黑脛病的田間防效

2022年3月，選取湖南省湘西自治州煙草黑脛病往年發(fā)生較重的煙田進行防效試驗。以菌株M10-4發(fā)酵液（1×108 CFU/mL）為試驗組，化學對照藥劑為68%精甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑1 000倍液，50%烯酰嗎啉可濕性粉劑1 000倍液，生物對照藥劑為10億CFU/g 枯草芽孢桿菌粉劑，空白對照為清水。每個處理50株，設置3個重復，隨機區(qū)組排列，四周設保護行3行，各處理的其他條件都與當?shù)乇３忠恢?。分別在移栽時，移栽后7、14、21 d進行灌根。按照《煙草病蟲害分級及調查方法》（GB/T 23222—2008）中的分級標準及調查方法，在最后一次灌根30 d后進行病害調查，記錄小區(qū)中的總株數(shù)及各級病株數(shù)，計算發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果，公式如下：

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)調查總株數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）調查總葉數(shù)×最高級代表值×100；

防治效果=對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對照病情指數(shù)×100%。

1.7 菌株M10-4的促生作用

1.7.1 產(chǎn)IAA能力測定 在100 mL的LB液體培養(yǎng)基中加入10 mg L-色氨酸，待完全溶解后接種菌株M10-4，放入30 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng) 48 h。定性觀察^［19］：將培養(yǎng)48 h后的菌液分裝至 2 mL 離心管中，離心取上清，加入等量Salkowski比色液，避光靜置30 min，觀察顏色變化。定量測定^［20］：LB液體培養(yǎng)基加入吲哚乙酸，配置成含吲哚乙酸0、10、20、30 mg/L的標準溶液，各取1 mL至 2 mL 離心管，加入等量Salkowski比色液，嚴格避光靜置30 min，分別測定D530 nm，制作標準曲線。測定加入Salkowski比色液的無菌發(fā)酵液D530 nm，代入標準曲線計算菌株M10-4的產(chǎn)IAA量^［21］。

1.7.2 溶鉀、溶磷能力測定 將溶鉀鉀長石培養(yǎng)基^［22］、溶磷無機磷培養(yǎng)基^［23］倒平板，用9 mm打孔器在中央打孔后，用移液器在孔內加入50 μL（D600 nm=2.0）菌液，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6～7 d后觀察有無溶鉀、溶磷圈產(chǎn)生^［24］。

1.7.3 產(chǎn)胞外蛋白酶、纖維素酶、噬鐵素能力測定 將脫脂奶粉培養(yǎng)基^［25］、CMC-Na培養(yǎng)基^［26］、CAS培養(yǎng)基^［27］分別倒平板，用9 mm打孔器在中央打孔后，用移液槍在孔內加入50 μL（D600 nm=2.0）菌液，置于 30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后觀察有無透明圈產(chǎn)生。纖維素酶試驗用剛果紅染色10 min后，再用 1 mol/L NaCl洗脫，觀察有無透明圈產(chǎn)生。

1.7.4 盆栽促生試驗 待煙草（云煙87）長出3～4張真葉時，挑選大小相近的煙苗移栽至盆中，用M10-4發(fā)酵液（濃度1×108 CUF/mL）灌根，以LB液體培養(yǎng)基作為對照，每個處理3次重復，每個重復5株煙。每隔7 d灌根1次，共灌根3次，30 d后測量根、莖、葉的各項指標^［28］。

1.8 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)處理、結果計算及標準曲線的繪制，利用SPSS Statistics 25對各組數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 菌株對煙草疫霉的拮抗效果

從煙草根際土壤中共分離得到66株細菌，對煙草疫霉有拮抗作用的有M10-4、MX-4、YFZ-8、DL-3、MCL-11、LJH-11等6株菌株（表1），其中以M10-4對煙草疫霉的拮抗效果最好，抑菌率為73.97%（圖1）。

2.2 菌株M10-4鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征 菌株M10-4在LB平板上 30 ℃ 培養(yǎng)48 h后菌落呈不透明乳白色，圓形，黏稠狀，表面光滑濕潤，邊緣平滑（圖2-a）。革蘭氏染色紅色，為陰性（圖2-b），菌體大小為（0.3～0.5） μm×（0.6～1.2） μm，短桿狀，無莢膜，無芽孢，無鞭毛（圖2-c）。

2.2.2 生理生化特性 菌株M10-4不能水解淀粉，V-P反應、甲基紅反應、吲哚反應均為陰性，不具有運動性；明膠液化、接觸酶反應、氧化酶反應、硝酸鹽還原為陽性，可利用檸檬酸鹽（表2）。

2.2.3 16S rDNA基因序列分析 對菌株M10-4 16S rDNA序列進行PCR擴增，得到長度1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物條帶。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索比對，結果顯示，與吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）同源性最高，達到99.86%。利用MEGAX軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株M10-4與吡咯伯克霍爾德氏菌（登錄號為CP094459.1）處于同一分支簇（圖3）。結合形態(tài)學和生理生化特性鑒定結果，將菌株M10-4鑒定為吡咯伯克霍爾德氏菌。同時將序列提交至NCBI GenBank獲得登錄號OR835659。

2.3 菌株M10-4抑菌譜

菌株M10-4對辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病、煙草靶斑病菌菌均有拮抗作用，抑菌率分別為68.59%、67.98%、66.25%、63.78%、58.05%（表3、圖4）。

2.4 菌株M10-4發(fā)酵濾液對煙草疫霉的抑制效果

菌株M10-4的發(fā)酵濾液對煙草疫霉有明顯抑制作用，濃度越高，抑制效果越好，濃度為30%時黑脛病菌生長明顯受抑制（圖5），抑菌率達72.75%。濃度為10%的菌株M10-4發(fā)酵濾液抑制煙草疫霉菌絲生長，菌絲腫大、畸形，粗細不一，原生質分布不均（圖6）。

2.5 菌株M10-4對煙草黑脛病的田間防效

在最后一次灌根30 d后，記錄田間煙苗患煙草黑脛病的病情等級，計算其發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果。使用M10-4發(fā)酵液處理的發(fā)病率為26.67%，病情指數(shù)為9.92，均顯著低于化學藥劑、生物藥劑及清水處理組；防治效果達60.70%，顯著高于化學藥劑、生物藥劑及清水處理組（表4）。

2.6 菌株M10-4促生特性

2.6.1 產(chǎn)IAA能力 加入Salkowski比色液避光靜置30 min后，肉眼可見顏色由淡黃色變成淺粉色，證明菌株M10-4可以產(chǎn)生長素IAA（圖7）。用紫外分光光度計測得比色后的發(fā)酵濾液D530 nm值為0.058，用4個梯度的吲哚乙酸標準溶液的D530 nm制作成標準曲線（y=0.006 1x+0.016 8，r2=0.978 4），由此計算出IAA產(chǎn)量為6.754 mg/L。

2.6.2 溶磷、溶鉀及產(chǎn)蛋白酶能力 菌株M10-4培養(yǎng)6～7 d后，在溶鉀、溶磷、脫脂奶粉培養(yǎng)基平板上可以明顯觀察到透明圈（圖8） CMC-Na培養(yǎng)基、CAS培養(yǎng)基平板無變化，表明菌株M10-4具有溶鉀、溶磷、產(chǎn)蛋白酶能力，無纖維素酶、噬鐵素的產(chǎn)出。

2.6.3 對煙株的促生作用 與對照組相比，經(jīng) M10-4 灌根處理過的煙株長勢更好（圖9）。處理組的株高、最大葉長、總鮮重、總干重、地上部干重均有顯著提升，增長率分別為115.22%、88.68%、70.88%、94.65%、96.13%。最大葉寬、根長、根鮮重、根干重也有一定的增加，增長率分別為18.35%、14.92%、18.89%、50.00%（表5）。

3 結論與討論

生防菌是生物防治的重要方法之一，分離和篩選優(yōu)質生防菌株是豐富煙草生防資源的重要手段。煙草根際土壤中有很多可以用作生防的微生物，其中包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）等具有相對優(yōu)勢的菌屬^［29］。本研究從煙草根際土壤中分離得到有拮抗效果的菌株M10-4，經(jīng)形態(tài)學、生理生化及分子鑒定其為吡咯伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。

目前已有報道伯克霍爾德氏菌作為生防菌防治植物病害。解星麗等研究發(fā)現(xiàn)，多噬伯克霍爾德氏菌（Burkholderia multivorans）WS-FJ9對林木病原菌物具有很好的生防潛力^［30］。許萌杏等分離得到洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cepacia）JX-1，其溫室防治番茄青枯病的防效達80.89%^［31］。任嘉紅等研究發(fā)現(xiàn)，吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007對楊樹潰瘍病具有防治及促生作用^［32-33］。劉璐等報道的吡咯伯克霍爾德氏菌S377對棉花黃萎病具有良好的生防潛力^［34］。于曉慶等從煙草根際分離得到吡咯伯克霍爾德氏菌Lyc2，對棉苗立枯病的溫室防效達48.8%^［35］。Wang等的研究表明，occidiofungin是菌株Lyc2抗真菌活性的重要成分^［36］。本研究發(fā)現(xiàn)，M10-4的無菌發(fā)酵液對煙草黑脛病病原菌有很好的抑制作用，使菌絲無法正常生長，發(fā)生畸形、腫大等變化，對煙草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、煙草靶斑病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病菌均有抑制作用。同時，M10-4在田間對煙草黑脛病表現(xiàn)出較好的防治效果。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是指對作物具有促生、防治、增產(chǎn)作用的微生物^［37］，可以增強植物對土壤中礦物質的吸收，比如一些不易被吸收的磷和鉀會被轉化為可吸收的形式，從而減少對化肥的依賴；能夠分泌鐵載體，充分利用環(huán)境中含量較低的鐵元素，具備產(chǎn)生植物激素、固氮、產(chǎn)生抗生素等功能^［38-39］。伯克霍爾德氏菌可以作為PGPR菌種，在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢到全基因組序列的吡咯伯克霍爾德氏菌有15種，其中對植物有益處的菌株為DSM 10685、mHSR5、Hargis、Lyc2、CH-67^［38］。韓超等研究發(fā)現(xiàn)，吡咯伯克霍爾德氏菌A12對煙草根的生長、葉綠素含量、光合及蒸騰速率均有促進作用^［40］。Li等分離得到了2株具有良好溶磷、固氮、產(chǎn)IAA和鐵載體的吡咯伯克霍爾德氏菌ZJ9和ZJ174^［41］。Han等的研究表明，在鹽脅迫條件下接種吡咯伯克霍爾德氏菌P10能促進花生幼苗的生長^［42］。本研究發(fā)現(xiàn)菌株M10-4具有產(chǎn)IAA、溶磷、溶鉀以及產(chǎn)蛋白酶的能力，對溫室內盆栽煙草具有促生作用，能顯著提升株高、最大葉長、總鮮重、總干重、地上部干重，有作為PGPR研究的潛力。

以上結果表明，吡咯伯克霍爾德氏菌M10-4在病害防控、促生方面均表現(xiàn)較好，具有較大的研究意義及應用前景。由于田間的環(huán)境較為復雜，存在許多不可控因素，因此在下一步的研究中，應著重于田間促生的效果，除此之外還需評估其生物安全性，研究其是否會產(chǎn)生污染環(huán)境的及影響土壤微生物的物質?？紤]到實際生產(chǎn)需要，還要更深入地研究生防菌株的發(fā)酵條件及其抑菌、促生物質。

本研究中分離的伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）M10-4對煙草疫霉在平板和大田試驗中有較好的抑制作用，無菌發(fā)酵液可以破壞煙草疫霉菌絲的正常生長，對辣椒疫霉病菌、煙草赤星病菌、煙草鐮刀菌根腐病菌、柑橘炭疽病、煙草靶斑病菌均有抑制作用。此外，M10-4能夠產(chǎn)IAA、溶磷、溶鉀、產(chǎn)蛋白酶，對盆栽煙株的生長有明顯促進作用，有作為PGPR研究的潛力。

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