汪 金,常 新,韓春榮,萬 珂,諶 輝,趙 靜,熊 鵑 （. 東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院/南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科，江蘇 南京 00；. 東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院/南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院病理科，江蘇 南京 00；. 悉尼大學醫(yī)學與健康學院，澳大利亞 新南威爾士 050）

甲狀腺癌常見于人體，發(fā)病率不斷升高[1]。超聲造影（contrast-enhanced ultrasound,CEUS）、穿刺及CT等早期診斷技術(shù)廣泛應用于甲狀腺癌的診斷，但準確度均有待提高[2-3]。甲狀腺癌進展慢，預后通常良好，但其引發(fā)的各種并發(fā)癥會影響患者身心健康[4]。盡早篩查出甲狀腺癌，并給予相應治療，能最大限度減輕疾病對患者的影響，因此有必要尋找敏感、準確的篩查手段。甲狀腺細胞癌變過程涉及多種因素，如基因的激活和失活、DNA的甲基化和突變、細胞內(nèi)通路的刺激等[5]。Smad泛素調(diào)節(jié)因子1（Smad ubiquitin regulatory factor 1，SMURF1）是一種C2-WW-HECT 泛素連接酶，屬于Nedd4 家族，在神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、肺和生殖器官等多個組織中表達[6]，參與病毒自噬、胚胎發(fā)生、骨穩(wěn)態(tài)調(diào)控等多種生物學過程[7]。SMURF1 已被證明在多種癌癥中發(fā)揮致癌作用，可促進腫瘤細胞增殖、遷移和上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，SMURF1 在甲狀腺癌組織中高表達，可促進甲狀腺癌的形成和發(fā)展[10]。本研究檢測了SMURF1 在甲狀腺癌患者血清中的表達水平，并分析超聲造影參數(shù)聯(lián)合血清SMURF1檢測對甲狀腺癌的診斷價值，以期為甲狀腺癌的臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院2019 年2月至2020年2月收治的144例TI-RADS4類結(jié)節(jié)患者為研究對象。根據(jù)組織病理學結(jié)果，將患者分為甲狀腺癌組（76 例）和良性組（68 例）。甲狀腺癌組中男36 例，女40 例；年齡（48.67±8.16）歲；病程（3.52±1.04）年；病灶：左側(cè)29 例、右側(cè)34 例、雙側(cè)6 例、峽部7 例；病理類型：乳頭狀癌66 例，混合癌2 例，髓樣癌2 例，濾泡癌3 例，未分化癌3 例。不同病理類型患者血清SMURF1 mRNA 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。良性組中男34 例，女34 例；年齡（50.42±7.65）歲；病程（3.18±0.79）年；病灶：左側(cè)25 例、右側(cè)31 例、雙側(cè)5 例、峽部7 例；病理類型：甲狀腺瘤36 例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫27 例，橋本氏甲狀腺炎5 例。納入標準：①手術(shù)及甲狀腺功能資料基本完整，不影響試驗；②確診甲狀腺癌，且均為1枚結(jié)節(jié)。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②合并糖尿病、高血壓、肺結(jié)核等；③嚴重器官功能衰竭；④心、腦血管疾病。2 組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)東南大學附屬中大醫(yī)院溧水分院醫(yī)學倫理委員會批準（2018-12-048），患者及家屬均知情并簽署同意書。

1.2 超聲造影檢查

由同一醫(yī)師使用彩色多普勒超聲診斷儀（Resona 8 型，探頭型號為L11-3U，探頭頻率為3～11 MHz）對所有患者進行檢查。經(jīng)肘靜脈推注1.5 mL造影劑，然后快速注射5.0 mL 生理鹽水沖洗，記錄超聲造影圖像。注意檢查過程中不得有吞咽動作，探頭于腫塊切面最大處固定，采集時間＞2 min。所得圖像均導入Qontrast 4.0 軟件進行分析，得出達峰時間（time to peak,TTP）、造影劑平均通過時間（mean transit time,MTT）、峰值強度（peak intensity,PI）、平均灌注強度（mean perfusion intensity,SImean）及最大灌注強度（maximum perfusion intensity,SImax）。

1.3 qRT-PCR法檢測血清SMURF1 mRNA表達

收集患者行超聲造影前的空腹外周血4～5 mL，靜置35～45 min，4 ℃下以4 200 r/min 離心10 min，分離血清，-70 ℃保存。解凍血清，利用TRIzol LS Reagent 提取總RNA；采用First-Strand cDNA Synthesis Kit 將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix、qRT-PCR 儀擴增cDNA，獲取循環(huán)閾值（Ct 值）。SMURF1 引物上游序列為5′-ACTCGGGACATACCT GCTCT-3′，下游序列為5′-GCCCTAGGGGAGTGACT ACA-3′，GAPDH 為SMURF1 的內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計算SMURF1 mRNA相對表達量。

1.4 評價指標

以手術(shù)切除病灶甲狀腺病理結(jié)果為金標準，以超聲造影所得PI、SImean 及SImax 為自變量繪制受試者工作特征（receiver operating characteristica,ROC）曲線，評估超聲造影對甲狀腺癌的診斷價值；以血清SMURF1 為自變量繪制ROC曲線，評估SMURF1 檢測對甲狀腺癌的診斷價值；以超聲造影準確度最高的參數(shù)SImax＜57.90 或血清SMURF1 mRNA＞1.42 為甲狀腺癌陽性，采用并聯(lián)方式診斷，四格表分析超聲造影參數(shù)聯(lián)合SMURF1檢測對甲狀腺癌的診斷價值。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗；計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（）表示，行獨立樣本t檢驗；以病理結(jié)果為金標準，以四格表/ROC曲線分析超聲造影、血清SMURF1 及二者聯(lián)合對甲狀腺癌的診斷價值。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清SMURF1 mRNA 水平和超聲造影參數(shù)比較

甲狀腺癌組超聲造影參數(shù)PI、SImean、SImax 均低于良性組（P＜0.05），SMURF1 mRNA 水平高于良性組（P＜0.05）；2 組患者TTP、MTT 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 血清SMURF1 mRNA水平和超聲造影參數(shù)比較

2.2 超聲造影對甲狀腺癌的診斷價值分析

ROC結(jié)果顯示，PI、SImean、SImax診斷甲狀腺癌的曲線下面積（area under the curve,AUC）分別為0.737、0.720、0.813，最佳截斷值分別為42.08、45.86、57.90，敏感度分別為75.00%、84.21%、82.89%，特異度分別為66.18%、55.88%、72.06%，準確度分別為70.83%、70.83%、77.78%，見圖1。SImax的AUC及準確度均顯著高于PI、SImean（P＜0.05）。

圖1 PI、SImean、SImax診斷甲狀腺癌的ROC曲線

2.3 SMURF1對甲狀腺癌的診斷價值分析

ROC曲線顯示，SMURF1 診斷甲狀腺癌的AUC為0.824（95%CI：0.828～0.937），截斷值為1.42，敏感度為65.79%，特異度為94.12%，準確度為79.17%，見圖2。

圖2 血清SMURF1診斷甲狀腺癌的ROC曲線

2.4 SImax、SMURF1診斷與病理學診斷的一致性比較

超聲造影參數(shù)SImax、SMURF1與病理診斷結(jié)果一致性均中等（P＜0.05），SImax 聯(lián)合血清SMURF1 檢測與病理診斷結(jié)果一致性較高（P＜0.05），見表2。

表2 SImax、SMURF1診斷與病理學診斷的一致性比較

2.5 SImax聯(lián)合SMURF1對甲狀腺癌的診斷價值

SImax 聯(lián)合SMURF1 診斷甲狀腺癌的敏感度和準確度均高于SImax、SMURF1 單獨診斷（P＜0.05）；且二者聯(lián)合預測預后的AUC為0.927，明顯高于二者單獨診斷（Z聯(lián)合vs.SImax=3.999，P＜0.001；Z聯(lián)合vs.SMURF1=3.270，P=0.001），見表3、圖3。

圖3 SImax聯(lián)合血清SMURF1診斷甲狀腺癌的ROC曲線

表3 超聲造影參數(shù)SImax聯(lián)合血清SMURF1 mRNA診斷甲狀腺癌的價值

3 討論

目前，臨床上疑似甲狀腺癌患者以穿刺和超聲為主要診斷手段，其中穿刺屬于有創(chuàng)檢查，且會出現(xiàn)假陰和假陽情況，而超聲可在一定程度上提高甲狀腺癌的檢出率，但其較低的特異度可能使檢查結(jié)果出現(xiàn)過度診斷情況，從而導致過度治療[11]。因此，本研究將血清SMURF1 與超聲造影參數(shù)聯(lián)合用于甲狀腺癌的診斷，以期提高甲狀腺癌的診斷準確率，降低過度診斷、過度治療等的發(fā)生率。

超聲造影需要靜脈注射造影劑，通過此種診斷探得病灶時間-強度曲線，并依靠得到的曲線情況判斷灌注情況[12]。其中TTP、MTT、PI、SImean 及SImax 均為重要參數(shù)，甲狀腺癌患者的曲線特征為TTP、MTT 短，快出慢進低增強[13]。甲狀腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移均與微血管形成密切相關(guān)，而超聲造影參數(shù)與微血管密度有關(guān)，其診斷腫瘤血管的價值較高[14]，因此，推測超聲造影參數(shù)診斷可能適用于甲狀腺癌的診斷。本研究中，甲狀腺癌組超聲造影參數(shù)PI、SImean、SImax均低于良性組，與黃鶯等[15]的研究結(jié)果一致。王春梅等[16]研究表明，TTP、MTT 與甲狀腺癌細胞增殖及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)，可以反映甲狀腺癌細胞活性；李梅等[17]發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌患者的超聲造影特征參數(shù)TTP、MTT 明顯高于良性患者，本研究結(jié)果與之不符。究其原因，可能與甲狀腺癌患者機體血管數(shù)量及不規(guī)則分支較多但分布不均、管網(wǎng)雜亂有關(guān)[18]，TTP、MTT 在甲狀腺良性、惡性病變機體中的差異可能不一致。另有研究表明，SImax 與微血管的密度相關(guān)性最高[13]。本研究結(jié)果顯示，超聲造影參數(shù)SImax 對甲狀腺癌的診斷價值最高，AUC為0.813，敏感度為82.89%，特異度為72.06%，準確度為77.78%，提示超聲造影參數(shù)SImax對甲狀腺癌具有較高的診斷價值，但其敏感度和準確度仍待提高。

SMURF1可在底物蛋白上添加單個或多個泛素分子來觸發(fā)蛋白質(zhì)的泛素化降解，參與細胞增殖等多種過程的調(diào)控，進而影響腫瘤進展[10]。SMURF1 在大多數(shù)腫瘤中被認為是致癌基因，可促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，導致腫瘤進展和預后不良[19]。有研究顯示，靶向SMURF1 和/或阻斷SMURF1 表達，降低其泛素化活性，有利于抑癌蛋白的穩(wěn)定，抑制腫瘤進展[10]。Bian[20]的研究表明，SMURF1在甲狀腺癌血清中異常高表達。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組血清SMURF1 水平顯著高于良性組，SMURF1 診斷甲狀腺癌的AUC為0.824，敏感度為65.79%，特異度為94.12%，準確度為79.17%，對甲狀腺癌有較高診斷價值，但敏感度較低，與上述研究一致，說明SMURF1 單獨診斷甲狀腺癌具有局限性。

近年來，影像學與血清因子聯(lián)合用于疾病評估的研究越來越多，影像學敏感度較好，血清指標具有較高特異度，二者聯(lián)合使用可提高甲狀腺癌的診斷準確度。有研究報道，超聲造影聯(lián)合球蛋白對于甲狀腺癌術(shù)前N 分期的預測具有較高價值[21]；超聲造影聯(lián)合血清TSHR對老年甲狀腺癌的診斷準確度為87.80%，高于超聲造影和血清TSHR單獨診斷[15]。本研究中，SImax聯(lián)合血清SMURF1 用于疾病評估的準確度高于單獨診斷，提示二者聯(lián)合診斷彌補了超聲造影、SMURF1單獨診斷的不足，降低了臨床高度懷疑而難以確診的甲狀腺癌患者的誤診率，具有較高應用價值。

綜上，超聲造影聯(lián)合血清SMURF1 檢測能有效提高甲狀腺癌的診斷效能，可在保證甲狀腺癌患者有效診斷的前提下，避免臨床甲狀腺癌患者的過度治療。但本研究樣本量較少且缺乏患者隨訪基本資料，未對超聲造影聯(lián)合血清SMURF1 與甲狀腺癌復發(fā)、預后的關(guān)系進行深入研究，后續(xù)將加大樣本量進一步研究。