張臘英,何安玲,陳明鍇 （武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060）

肝纖維化是肝發(fā)生廣泛的慢性損傷后引起肝修復(fù)愈合失調(diào)的過(guò)程。在慢性病毒性肝炎、膽源性肝病、乙醇、自身免疫性肝炎和非酒精性肝病等的作用下，肝細(xì)胞損傷后激活靜止的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSC）并轉(zhuǎn)化為具有增殖、遷移和收縮能力的肌成纖維細(xì)胞。纖維化細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）主要由肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，如Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維、彈性蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖等，這些細(xì)胞具有促進(jìn)纖維化轉(zhuǎn)錄和分泌的特性，在纖維化和炎癥反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1]。肝纖維化進(jìn)展是增加慢性肝病患病風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。然而肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展通常較為隱匿，大部分肝纖維化患者會(huì)在15～20年進(jìn)展為肝硬化[2]。肝硬化是進(jìn)行性肝纖維化的終末期階段，其并發(fā)癥如食管胃底靜脈曲張出血、難治性腹水、肝性腦病和肝癌等疾病會(huì)加速肝硬化的進(jìn)展[3]。在去除致病因子后肝纖維化過(guò)程可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)，但逆轉(zhuǎn)過(guò)程通常較為緩慢或不明顯[4]。許多抗肝纖維化研究的藥物在動(dòng)物模型中有較好的抗纖維化效果，但在臨床試驗(yàn)中效果不甚顯著[5]。當(dāng)前臨床仍缺乏有效且特異的抗肝纖維化藥物，因此探索肝纖維化機(jī)制并尋找潛在藥物治療靶點(diǎn)具有重要的臨床和社會(huì)意義。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析肝纖維化樣本與健康肝樣本的差異表達(dá)基因，以期發(fā)現(xiàn)肝纖維化中相關(guān)信號(hào)通路和關(guān)鍵基因，為早期肝纖維化的檢測(cè)和診斷提供新的證據(jù)支持，為抗肝纖維化的藥物治療提供潛在的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/）GPL28576平臺(tái)中獲得基因表達(dá)譜GSE197112，包含4個(gè)肝纖維化組織樣本和4個(gè)正常肝組織樣本。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

Limma（linearmodels for microarray data, DOI:10.1093/nar/gkv007）是一種基于廣義線性模型的常用差異表達(dá)篩選方法。通過(guò)Limma 篩選差異表達(dá)基因，將GSE197112 數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)分為肝纖維化組和非肝纖維化組。設(shè)置P值和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。P＜0.01，∣Log2FC∣＞1.5時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用R語(yǔ)言繪制火山圖和熱圖。

1.3 功能富集和通路分析

DAVID 是一個(gè)公共生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)[6]，其在線分析工具可對(duì)大量基因或蛋白快速進(jìn)行處理并得出綜合性生物功能注釋信息[7]。本研究將差異表達(dá)基因中的上調(diào)基因和下調(diào)基因分別導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.4 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵基因篩選

STRING（http://string-db. org/）是一個(gè)收集了近百萬(wàn)種蛋白種類(lèi)及蛋白之間相互作用信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以在線分析蛋白相互作用。將獲取的差異表達(dá)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)以評(píng)估其PPI 關(guān)系，運(yùn)用Cytoscape(V3.9.1)中MCODE 插件提取PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵蛋白模塊，取前5位基因?yàn)殛P(guān)鍵基因，并構(gòu)建關(guān)鍵基因間的PPI 網(wǎng)絡(luò)[8]。同時(shí)通過(guò)Cytoscape 軟件中的插件CytoHubba篩選肝纖維化靶點(diǎn)基因。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因

通過(guò)R4.2.0軟件對(duì)GSE197112進(jìn)行提取及處理，結(jié)果顯示，在該數(shù)據(jù)集中存在300 個(gè)與肝纖維化相關(guān)的下調(diào)基因和99 個(gè)與肝纖維化相關(guān)的上調(diào)基因。使用R 軟件繪制肝纖維化差異表達(dá)基因表達(dá)的火山圖（圖1）和熱圖（圖2）。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

圖2 聚類(lèi)熱圖

2.2 功能富集分析和通路分析

利用DAVID 在線分析工具對(duì)肝纖維化數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因的生物過(guò)程、基因的分子功能和細(xì)胞組分進(jìn)行富集分析，差異表達(dá)基因主要涉及的生物過(guò)程包括有絲分裂檢驗(yàn)點(diǎn)、染色體分離、細(xì)胞分裂、適應(yīng)性免疫應(yīng)答、有絲分裂紡錘體組織、DNA 復(fù)制、細(xì)胞凋亡過(guò)程、有絲分裂紡錘體微管附著在動(dòng)粒上、免疫應(yīng)答、中板集合。細(xì)胞組分相關(guān)分析顯示，差異表達(dá)基因主要參與動(dòng)粒、染色體著絲粒區(qū)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、網(wǎng)管復(fù)合體、濃縮染色體外動(dòng)粒、中心體、Ndc80復(fù)合體、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用。差異表達(dá)基因主要參與的基因的分子功能包括蛋白質(zhì)結(jié)合、MHC Ⅱ類(lèi)受體活性、鈣離子結(jié)合、微管結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶激活劑活性、ATP依賴性微管運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、模式識(shí)別受體活性（圖3）。KEGG分析顯示，差異表達(dá)基因主要富集于細(xì)胞周期、p53 信號(hào)通路、人T 細(xì)胞白血病病毒1 感染、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、抗原處理和呈遞、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)、細(xì)胞黏附分子等途徑（圖4）。

圖4 KEGG富集通路分析及相關(guān)基因

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)生成及關(guān)鍵基因篩選

利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建肝纖維化中差異表達(dá)基因表達(dá)產(chǎn)物的PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖5）。使用Cytoscape 可視化軟件根據(jù)Degree 值繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化圖（圖6）。利用Cytoscape 軟件中MCODE 插件，根據(jù)邊和節(jié)點(diǎn)的關(guān)系，建立關(guān)鍵蛋白模塊PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖7a）。此外，使用CytoHubba 插件利用MCC 算法篩選排名前5 的關(guān)鍵基因，分別為：TTK、KIF2C、ASPM、DLGAP5、PBK，其相互作用關(guān)系見(jiàn)圖7b。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析圖

圖6 通過(guò) Cytoscape軟件可視化PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果

圖7 PPI網(wǎng)絡(luò)5個(gè)模塊及hub基因

3 討論

肝纖維化是一個(gè)重大的全球公共衛(wèi)生健康問(wèn)題，肝纖維化進(jìn)展到肝硬化和/或肝細(xì)胞癌是影響患者生活質(zhì)量及預(yù)后的主要因素[9]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析了肝纖維化患者的差異表達(dá)基因，使用GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析揭示了差異表達(dá)基因主要的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)基因在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用，有助于探索肝纖維化藥物治療的新靶點(diǎn)。

本研究通過(guò)KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)肝纖維化差異表達(dá)基因富集在細(xì)胞周期信號(hào)通路。細(xì)胞周期信號(hào)通路是發(fā)生肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路共同交匯的通路之一。Cyclin E1（CcnE1）是一種E型細(xì)胞周期蛋白，其在HSC 中大量表達(dá)，使細(xì)胞周期活性增加，參與HSC 的活化與增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成和肝纖維化[10]。隨后有研究證明，抑制肝細(xì)胞和HSC 中CcnE1表達(dá)和細(xì)胞周期活性可顯著改善肝纖維化[11]。免疫相關(guān)途徑可能促進(jìn)了肝細(xì)胞癌的發(fā)展，IgA 生成途徑的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)信號(hào)通路參與了肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，有助于細(xì)胞的增殖和遷移，抑制該信號(hào)通路的激活可能是治療肝細(xì)胞癌的潛在機(jī)制[12]。孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號(hào)通路與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-14]?？乖幚砗统蔬f信號(hào)通路通過(guò)影響炎癥反應(yīng)促進(jìn)丙型肝炎病毒致癌過(guò)程[15]。HOXA9 具有介導(dǎo)細(xì)胞分化、凋亡、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及代謝等功能[16]。本研究中HOXA9 富集在癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號(hào)通路上，可能作為研究肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。細(xì)胞黏附分子如鈣黏蛋白黏附家族、整合素家族、免疫球蛋白超家族以及選擇素等形成了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)黏附[17]。在肝纖維化中，整合素是ECM、炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間連接的主要節(jié)點(diǎn)，與組織纖維化的啟動(dòng)、維持密切相關(guān)[18]。細(xì)胞黏附分子與肝纖維化相互影響，其能夠通過(guò)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor beta,TGF-β）或介導(dǎo)白細(xì)胞遷移促進(jìn)纖維化，肝慢性炎癥和纖維化過(guò)程中細(xì)胞黏附分子的表達(dá)水平會(huì)上調(diào)。整合素和纖維化的ECM 促進(jìn)TGF-β 的釋放，TGF-β 繼而上調(diào)整合素的表達(dá)并激活HSC 分化為肌成纖維細(xì)胞，合成更多的纖維化ECM，進(jìn)入組織纖維化的循環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，整合素抑制劑可在體內(nèi)下調(diào)TGF-β 介導(dǎo)的信號(hào)通路，從而減少肝纖維化的發(fā)生[19]。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)上述通路與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而與肝纖維化的研究較少，肝纖維化中上述信號(hào)通路及差異表達(dá)基因可能成為肝纖維化治療的潛在靶點(diǎn)。

TTK 蛋白激酶由人單極紡錘體1 基因編碼，即單極紡錘體1 激酶，對(duì)于有絲分裂檢查點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)和染色體穩(wěn)定性至關(guān)重要。有絲分裂檢查點(diǎn)可控制細(xì)胞有絲分裂過(guò)程[20]。TTK 以p53 依賴性方式激活A(yù)KT 途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生，在肝細(xì)胞癌中起著重要作用[21]。TTK 高表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者生存率較低，抑制TTK 高表達(dá)能有效抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)展[22-23]。ASPM 即異常紡錘體樣小頭畸形相關(guān)基因，其高表達(dá)可能與乙型肝炎的惡性進(jìn)展有關(guān)，并且與肝細(xì)胞癌的預(yù)后不良有關(guān)[24]。KIF2C 是一種重要的有絲分裂調(diào)節(jié)因子，在有絲分裂過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[25]。KIF2C 與各種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。KIF2C過(guò)表達(dá)上調(diào)了細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PCNA 和CDC20 的表達(dá)，通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase,ERK）途徑促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，最終促進(jìn)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并與預(yù)后不良相關(guān)[26-27]。DLGAP5 在肝細(xì)胞癌中的發(fā)展分子機(jī)制研究有限，DLGAP5參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，與肝細(xì)胞癌患者的總生存期顯著相關(guān)，可能是肝細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)志物[28]。PBK 是MAPK 家族的絲氨酸-蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖、生長(zhǎng)、凋亡和炎癥[29]。PBK 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，其高表達(dá)與較短生存期相關(guān)，有助于預(yù)測(cè)癌癥預(yù)后[30]。本研究確定的關(guān)鍵基因更多地集中在肝纖維化領(lǐng)域，而較少集中在肝細(xì)胞癌領(lǐng)域，這些基因有望成為肝纖維化藥物治療的新靶點(diǎn)。

綜上，本研究確定了肝纖維化399 個(gè)差異表達(dá)基因，成功構(gòu)建了肝纖維化中差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選出可能參與肝纖維化過(guò)程的5 個(gè)關(guān)鍵基因，為尋找肝纖維化新的治療靶點(diǎn)提供了思路，但未來(lái)需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證該結(jié)論。