付仕林,易雪嬌,潘文旭,尹 純,康華利,錢德慧 （陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400037）

近年來，血管外科和介入手術(shù)飛速發(fā)展，大大優(yōu)化了狹窄和閉塞性血管疾病的治療。但合并血管鈣化嚴重影響了上述治療的效果，同時增加了術(shù)后血栓形成風險[1]。傳統(tǒng)觀念認為血管鈣化是被動退化過程，近年來發(fā)現(xiàn)血管鈣化與骨形成相似，是血管壁微環(huán)境內(nèi)主動可調(diào)控的細胞介導過程。多種細胞如血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等參與了血管鈣化的發(fā)生發(fā)展，也包括細胞間對話調(diào)節(jié)[2]，其中VSMCs 向成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化是這一過程的核心環(huán)節(jié)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞Jagged1 在抑制VSMCs 向其他表型轉(zhuǎn)化方面具有重要作用[4]，而骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP7）是促進VSMCs向成骨表型轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[5]。同時，在成骨細胞中BMP7可通過下游信號轉(zhuǎn)導蛋白抑制Jagged1 蛋白表達[6]。因此，我們推測內(nèi)皮細胞Jagged1 可能是BMP7 調(diào)控VSMCs 鈣化的中間分子。本研究采用基因重組方法，構(gòu)建BMP7 過表達慢病毒載體，分析BMP7 過表達對小鼠主動脈內(nèi)皮細胞Jagged1 表達的影響及其對共培養(yǎng)VSMCs 鈣化的影響，以期為血管鈣化的機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

20 只2～3 周齡SPF 級KM 小鼠購自陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCK（渝）20170002。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNAiso plus，DH5α 感受態(tài)，核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XholⅠ購自日本TaKaRa 公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自美國Omega 公司；Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNASynthesis Kit (gDNA digester plus)、Hieff UNICON?Universal Blue QPCR SYBR Green Master Mix 購自上海YEASEN公司。Jagged1抗體（兔來源）購自英國Abcam公司，HRP 標記山羊抗兔IgG 二抗購自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠主動脈內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定 參考Kobayashi 等[7]的方法并改良，將10 只KM 小鼠采用頸椎脫臼法快速處死后消毒，在無菌操作臺上分離完整的主動脈，剝離主動脈血管周圍的脂肪組織以及血管外膜，PBS 反復沖洗后，將主動脈切成大小為1 mm×1 mm的組織塊，并內(nèi)膜朝下均勻種植在多聚賴氨酸包被后的6孔培養(yǎng)皿上；于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d 后換液；待組織塊周圍爬出的細胞達到培養(yǎng)皿底面積80%后，用0.25%的胰酶消化傳代。通過檢測CD31 的方法，免疫組化染色后熒光顯微鏡下觀察鑒定血管內(nèi)皮細胞。本實驗使用的是第3代細胞。

1.2.2 小鼠主動脈VSMCs 原代培養(yǎng)及鑒定 參考郝思雨等[8]的方法進行VSMCs 原代培養(yǎng)及鑒定。按1.2.1中的方法分離10 只KM 小鼠主動脈后，使用顯微彈簧剪沿血管縱軸剪開主動脈，用顯微鑷子剔除血管外膜層，再翻轉(zhuǎn)至內(nèi)側(cè)輕輕刮去血管內(nèi)膜層。用PBS沖洗血管中膜層，眼科剪將組織剪至1 mm×1 mm×1 mm 大小。用膠原蛋白酶Ⅰ消化30 min 后，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基吹散細胞，移入培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d 后換液。待組織塊細胞長滿培養(yǎng)皿底面積80%后，用0.25%的胰酶消化傳代。通過檢測α-SMA 的方法，免疫組化染色后熒光顯微鏡下觀察鑒定VSMCs。本實驗使用的是傳代至第3代的細胞。

1.2.3 BMP7 過表達慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)目的基因信息Mouse-BMP7（NM_007557.3）進行序列合成，5'端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點XholⅠ，3'端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點BamH Ⅰ，并將其連入載體pLVX-zsGreen-C1 中（圖1）。將合成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，從平板上挑取克隆菌落，小量抽提質(zhì)粒并進行鑒定挑出陽性克隆。分別利用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XholⅠ雙酶切提取的質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，切下片段與目的DNA 大小一致的質(zhì)粒載體，命名為Mouse-BMP7-pLVX-zsGreen-C1，送上海生工測序鑒定。

圖1 質(zhì)粒信息

1.2.4 慢病毒包裝純化和滴度測定 制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，組成為pLVXIRES-ZsGreen1、psPAX2、pMD2. G。其中穿梭質(zhì)粒pLVX-IRES-ZsGreen1上攜帶有CMV啟動的目的基因，且能表達綠色熒光蛋白篩選標記基因；psPAX2、pMD2.G 含有病毒包裝所必須的元件。3 種質(zhì)粒載體分別進行高純度無內(nèi)毒素大量抽提，共轉(zhuǎn)染人胚腎細胞293T細胞，轉(zhuǎn)染后16～24 h更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，多次收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液；最后，Amicon Ultra-15 100 kDa 對上清液進行濃縮處理，得到高滴度的慢病毒濃縮液，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^熒光顯微鏡或FACS 計數(shù)熒光細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.2.5 BMP7 過表達慢病毒感染 在原代培養(yǎng)的第3 代小鼠主動脈內(nèi)皮細胞上應用制備完成的BMP7過表達慢病毒感染48～96 h 后，通過熒光顯微鏡檢查熒光蛋白表達的情況，以此估算慢病毒對目標細胞的感染效率。提取感染后細胞的RNA，先用隨機引物將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，隨后用qPCR 法對BMP7 過表達慢病毒的感染效率進行檢測。內(nèi)參和目的基因引物如下：GAPDH-F 為GGCAAGTTCAACGGCA CAG，GAPDH-R 為CGCCAGTAGACTCCACGACAT；BMP7-F 為CAGCCAGAATCGCTCCAAGA，BMP7-R 為TGCAATGATCCAGTCCTGCC。

1.2.6 Western blot 檢測Jagged1蛋白 設置3組細胞實驗：正常內(nèi)皮細胞為正常對照組，內(nèi)皮細胞+BMP7 過表達慢病毒感染為BMP7 過表達組，內(nèi)皮細胞+慢病毒空載體為空載體對照組，每組重復3次。各組細胞裂解后，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中劇烈振蕩30 s后放入離心機，于4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液用BCA 法測定蛋白濃度，取等量預處理的蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE 電泳，恒流200 mA 電轉(zhuǎn)1 h至PVDF 膜，5%脫脂奶粉-PBST 室溫封閉1 h后，加入Jagged1 和內(nèi)參GAPDH 一抗，于4 ℃孵育過夜。用山羊抗兔IgG 二抗37 °C 溫育1 h。按照ECL 發(fā)光試劑盒的說明進行操作，并使用凝膠成像裝置進行曝光和拍照。

1.2.7 內(nèi)皮細胞和VSMCs 共培養(yǎng)體系建立與誘導鈣化 參照Fillinger 等[9]的方法建立間接共培養(yǎng)體系。將1.2.6 中3 組細胞分別接種于Transwell 膜上，同時將VSMCs接種于6孔培養(yǎng)板的底部。加入鈣化培養(yǎng)基（10 mmol/L β-磷酸甘油、1×10-7mol/L 胰島素及50 μg/L維生素C)以誘導主動脈VSMCs 鈣化，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，每2～3 d 更換培養(yǎng)液。最后用茜素紅染色檢測VSMCs的鈣化情況。每組3 枚蓋玻片置入6 孔培養(yǎng)板制備小鼠主動脈VSMCs 爬片。4 ℃沖洗液洗滌細胞爬片2 次，冰丙酮固定20～30 min 后取出。每個VSMCs 爬片加入10 g/L 的茜素紅S 試劑(pH=6.3)，室溫下染色5～10 min，用蒸餾水沖洗1～2 次后，顯微鏡下觀察染色效果。用紫外可見分光光度計測定562 nm 波長處的光密度（optical density,OD）值。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，呈正態(tài)分布且方差齊性的數(shù)據(jù)2組間比較采用t檢驗，否則采用校正t檢驗或秩和檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動脈內(nèi)皮細胞及VSMCs培養(yǎng)及鑒定

將分離培養(yǎng)的第3代內(nèi)皮細胞及VSMCs經(jīng)免疫組化后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，分離的細胞為內(nèi)皮細胞及VSMCs，且純度均在95%以上。

2.2 BMP7過表達慢病毒載體酶切鑒定

分別利用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、XholⅠ酶切重組質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物電泳，電泳結(jié)果見圖2；基因測序證實酶切的重組質(zhì)粒為實驗所需的BMP7 過表達慢病毒載體。

圖2 BMP7過表達慢病毒載體酶切鑒定結(jié)果

2.3 BMP7過表達慢病毒感染細胞熒光鑒定

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，空載病毒與BMP7 過表達慢病毒均成功轉(zhuǎn)染至小鼠主動脈內(nèi)皮細胞，其轉(zhuǎn)染效率分別約為70%和30%（圖3）。

圖3 BMP7過表達慢病毒感染細胞與空載病毒感染細胞觀察

2.4 BMP7 過表達慢病毒感染主動脈內(nèi)皮細胞后BMP7 mRNA變化

qPCR 檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，BMP7過表達組的BMP7 mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0.01），空載體對照組BMP7 mRNA 無顯著變化（P＞0.05），見圖4。

圖4 各組mRNA相對表達量

2.5 BMP7 過表達慢病毒感染主動脈內(nèi)皮細胞后Jagged1蛋白表達變化

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，BMP7 過表達組的Jagged1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），而空載體對照組的Jagged1 蛋白表達水平無明顯差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 Western blot檢測小鼠主動脈內(nèi)皮細胞Jagged1蛋白的表達

2.6 BMP7 過表達內(nèi)皮細胞對共培養(yǎng)VSMCs 鈣化的影響

茜素紅染色結(jié)果顯示，與感染BMP7 過表達慢病毒的內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后，BMP7 過表達組VSMCs 的鈣化程度較正常對照組和空載體對照組均明顯增加（P＜0.01），見圖6。

圖6 各組茜素紅染色情況

3 討論

VSMCs 向成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化包括VSMCs 收縮表型標志物表達降低和成骨細胞標志物表達增高的演化過程，是血管鈣化的核心環(huán)節(jié)[3]。在高齡動脈血管壁中，BMP-Smads、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等骨形成關(guān)鍵信號通路的激活以及鈣調(diào)蛋白、骨保護素等抑制鈣化因子的丟失會促使VSMCs 向成骨樣表型轉(zhuǎn)化[10]。在老年人主動脈中層及高齡小鼠主動脈VSMCs 中均發(fā)現(xiàn)成骨標志物蛋白高表達，同時VSMCs收縮表型標志物明顯降低[11]。因此，血管的鈣化與VSMCs的成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

既往研究提示，BMP7 在血管鈣化中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。首先，BMP7 通過調(diào)節(jié)血管相關(guān)多能祖細胞的表型可塑性來調(diào)節(jié)血管鈣化[12]。在鈣化性動脈粥樣硬化標本中，BMP7表達上調(diào)最為顯著[13]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，衰老可以通過下調(diào)miR542-3p 增加其靶基因BMP7 的表達，從而發(fā)揮促進VSMCs 向成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化的作用[14]，而上調(diào)BMP7 是如何導致VSMCs向成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化的機制尚不明確。

本實驗成功構(gòu)建了小鼠BMP7 過表達慢病毒載體并感染至小鼠主動脈內(nèi)皮細胞。qPCR 檢測結(jié)果提示：轉(zhuǎn)染BMP7 過表達慢病毒的小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中BMP7 mRNA 的表達水平顯著上調(diào)。Notch 信號通路在血管的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了較為重要的調(diào)控作用[15]。血管壁組織中的Notch 信號系統(tǒng)包括Notch 受體（Notch1～4）和配體（Jagged1、2 和DLL1、3、4）等，其中Jagged1是主要分布在內(nèi)皮細胞的Notch配體[16]。既往研究表明，在多種細胞中BMP7 可通過下游信號轉(zhuǎn)導蛋白抑制Jagged1 蛋白的表達[6,17]。本研究也觀察到BMP7 過表達慢病毒轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞中Jagged1 蛋白表達水平明顯降低。因此，Jagged1可能是內(nèi)皮細胞中BMP7的下游信號分子。

本研究還發(fā)現(xiàn)，感染BMP7 過表達慢病毒的內(nèi)皮細胞與VSMCs 共培養(yǎng)后，VSMCs 的鈣化程度增加了2倍。內(nèi)皮細胞調(diào)控VSMCs功能主要通過細胞間直接接觸和旁分泌作用實現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)，Jagged1-Notch3通路是內(nèi)皮細胞和VSMCs 間交流的關(guān)鍵信號通路[18]。細胞間調(diào)控可激活VSMCs 的Notch3 信號并維持其收縮表型，減少其向成骨細胞樣表型轉(zhuǎn)化。提示上調(diào)內(nèi)皮細胞BMP7 表達，可降低其Jagged1 表達，并促進共培養(yǎng)體系中VSMCs的鈣化。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了BMP7 過表達慢病毒載體并感染至小鼠主動脈內(nèi)皮細胞。在細胞實驗中，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)小鼠主動脈內(nèi)皮細胞BMP7 的表達后，其Jagged1 的表達降低，并促進了共培養(yǎng)體系中VSMCs 的鈣化。但目前只是內(nèi)皮細胞調(diào)控VSMCs 鈣化分子機制的初步探索，內(nèi)皮細胞Jagged1究竟是通過何種途徑影響VSMCs鈣化尚需進一步研究。