摘 要：為了解賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）的遺傳特征，采用8對SSR分子標(biāo)記對來自賀蘭山東麓銀川、永寧、青銅峽等6個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的19株葡萄霜霉病菌菌株樣本進(jìn)行遺傳多樣性研究，分析病原菌遺傳分化現(xiàn)象與產(chǎn)區(qū)之間的關(guān)系。SSR標(biāo)記結(jié)果表明，供試菌株間存在遺傳變異現(xiàn)象，菌株間親緣關(guān)系均較近。當(dāng)相似系數(shù)為0.708時(shí)，19株菌株被聚為3大類，并且遺傳分化現(xiàn)象與地理分布具有一定的相關(guān)性。結(jié)果表明，賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)的葡萄霜霉病菌菌株之間存在遺傳變異現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：葡萄霜霉病菌; SSR分子標(biāo)記; 遺傳多樣性

中圖分類號：S436.631""""""" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A""""" 文章編號：1002-204X（2024）11-0099-05

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2024.11.017

SSR Genetic Diversity Analysis of Plasmopara viticola in Eastern Foot

of Helan Mountain

Song Shuang， Jiang Caige， Wang Guozhen， Zhang Yi*

（Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Ningxia Key Laboratory of Plant Disaeses and Pests Control， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract To clarify the populationgenetic structure of Plasmopara viticola in the eastern foot of Helan Mountain， the population genetic diversity of 19 strains of Plasmopara viticola collected from six different producing areas， including Yinchuan， Yongning and Qingtongxiain the eastern foot of Helan Mountain was studied by 8 pairs of SSR markers， and the relationship between genetic differentiation of pathogenic bacteriaand producing areas was analyzed. The results of SSR markers showed that there was genetic variation among the tested strains， and the genetic relationship between the strains was close. When the similarity coefficient was 0.708， the 19 strains were clustered into three categories， and there was a correlation between the genetic differentiation and geographical distribution of Plasmopara viticola in the eastern foot of Helan Mountain. The results showed that there was genetic variation among grape downy mildew strains in different producing areas in the eastern foot of Helan Mountain.

Key words Plasmopara viticola; SSR markers; Genetic diversity

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)保護(hù)科技創(chuàng)新示范課題（NGSB-2021-4-04）、2021年第六批自治區(qū)青年科技人才托舉工程。

作者簡介：宋雙（1987—），女，山東諸城人，碩士，助理研究員，研究方向?yàn)槠咸巡∠x害。

*通信作者：張怡（1968—），男，寧夏中衛(wèi)人，碩士，研究員，主要從事農(nóng)林病蟲害防治研究。

收稿日期：2023-09-11

葡萄是寧夏回族自治區(qū)最具有區(qū)域優(yōu)勢的特色產(chǎn)業(yè)之一。由于與法國波爾多地區(qū)同處于北緯37°～39°之間，寧夏賀蘭山東麓被世界公認(rèn)為釀酒葡萄種植的“黃金地帶”。該產(chǎn)區(qū)日照充足，晝夜溫差大，水熱系數(shù)佳，砂石土壤富含礦物質(zhì)，產(chǎn)出的葡萄具有香氣發(fā)育完全、色素形成良好、糖酸比例協(xié)調(diào)等特點(diǎn)。這些得天獨(dú)厚的氣候條件保證了葡萄漿果的品質(zhì)，為生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄酒提供了充足的優(yōu)質(zhì)原料[1-2]。

葡萄霜霉病（grape downy mildew）是世界上影響葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量最重要的病害之一，可以侵染葡萄的任何綠色組織[3]。該病害由葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola （Berk.et Curtis） Berl.et de Toni）引起，該菌隸屬于卵菌門單軸霉菌屬，是一種專性寄生菌[4]，具備無性繁殖和有性繁殖兩種生殖方式，在一個(gè)生長季可多次反復(fù)侵染[5]，這可能導(dǎo)致各生殖周期都有遺傳變異發(fā)生[6]。

賀蘭山東麓釀酒葡萄種植面積占全國的1/3，是全國集中連片最大的產(chǎn)區(qū)，同時(shí)也是葡萄霜霉病發(fā)生比較嚴(yán)重的地區(qū)。隨著露地種植面積的不斷擴(kuò)大及種植年限的增加，葡萄霜霉病已成為影響葡萄產(chǎn)業(yè)健康、安全發(fā)展的制約因素[7-8]。因此，了解該地區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳特征至關(guān)重要。本研究運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)[9]，對石嘴山產(chǎn)區(qū)、賀蘭產(chǎn)區(qū)、銀川產(chǎn)區(qū)、永寧產(chǎn)區(qū)、青銅峽產(chǎn)區(qū)及紅寺堡區(qū)產(chǎn)區(qū)的葡萄霜霉菌進(jìn)行遺傳多樣性研究，明確賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳特征，以期為該病的綜合防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株（表1）采自賀蘭山東麓青銅峽市、紅寺堡區(qū)，以及銀川市三區(qū)兩縣的部分區(qū)域的葡萄種植區(qū)。采集的病葉用報(bào)紙隔開、標(biāo)記，放入冰盒后帶回實(shí)驗(yàn)室。

接種材料為栽植于永寧縣金沙林場試驗(yàn)基地葡萄園內(nèi)新鮮、健康的“紅地球”嫩葉。

1.2 主要試劑及儀器

試劑：ddH2O、無水乙醇、瓊脂粉、OMEGA公司生產(chǎn)的E-Z96 Fungal DNA Kit提取試劑盒（D3390-01）、瓊脂糖。

儀器：植物光照培養(yǎng)箱（MLR-352H-PC，松下電器中國有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（JK-WBN-300A，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司）、紫外分光光度計(jì)（UV-280，尤尼科上海儀器有限公司）、PCR儀（Light Cycler96，瑞士Roche生物科技公司）、搖床（TS-2403CL，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司）、凝膠成像儀（G：BOX F3，英國Syngene基因有限公司）、測序儀（3730XL，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、低溫離心機(jī)（HF-2100R，上海趙迪生物科技有限公司）、電泳儀（HE33，美國Hoefer電泳制造公司）、微型旋渦混合儀（XH-D，上海比朗儀器制造有限公司）、制冰機(jī)（ZB-15，廣東星星制冷設(shè)備有限公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1BU，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、移液槍（Research plus，德國eppendorf生物技術(shù)公司）、超低溫冰箱（DW-86L288，青島海爾電器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄霜霉病菌純培養(yǎng)物的獲取

在田間盡可能采集新鮮、干凈、未噴施過殺菌劑的單斑病葉。先用自來水將病葉表面沖洗干凈，再用無菌水沖洗病葉的背面，確保將霜霉病菌霉層完全沖洗干凈，甩干葉片上殘留的水分;之后，將葉背向上置于鋪有4層濕潤紗布的白瓷盤上，用保鮮膜封口，放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為25 ℃，并在黑暗條件下保濕培養(yǎng)24 h。待病葉上再次長出厚厚的新鮮霉菌層時(shí)，用毛筆將霉層刷入裝有無菌水的燒杯中，適當(dāng)稀釋，制成濃度為8×105個(gè)·mL-1的菌懸液備用。

首先，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈉對采集的健康“紅地球”葉片消毒30 s，然后用無菌水沖洗幾次，甩干葉片表面多余水分。在超凈工作臺上用直徑為15 mm的打孔器將葉片打成圓形葉盤，避開主脈和較大的側(cè)脈，然后將葉背向上置于鋪有濕潤無菌濾紙、直徑為18 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，并在葉盤中央滴20 μL之前稀釋好的菌懸液。將處理好的培養(yǎng)皿置于25 ℃光照培養(yǎng)箱，在黑暗條件下培養(yǎng)24 h后，用無菌吸水紙吸取葉盤上多余的菌液，用保鮮膜密封，繼續(xù)在25 ℃條件下進(jìn)行12 h光暗交替培養(yǎng)，直至形成新鮮的霉層，即獲得了葡萄霜霉病菌的純培養(yǎng)。

將純培養(yǎng)獲得的葡萄霜霉病菌葉盤分別裝入50 mL的離心管中，不同來源的霜霉病菌要作好標(biāo)記，放入-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 葡萄霜霉病菌DNA的提取

供試菌株的基因組DNA提取[10-11]使用OMEGA公司生產(chǎn)的E-Z96 Fungal DNA Kit提取試劑盒（D3390-

01）;使用紫外可見分光光度計(jì)測定提取的DNA純度與濃度，檢測合格后放入-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 簡單重復(fù)序列的擴(kuò)增

引物篩選：參照已公布的47對引物[12-13]，篩選出適合葡萄霜霉菌遺傳多樣性研究的8對SSR特異性引物。這些引物由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)合成，并采用HEX、TAMRA和FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記（表2）。以提取的DNA為模板，使用篩選出的8對SSR特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

20 μL PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 1 μL、引物F和引物R各1 μL、dNTP（Mix）1 μL，Taq Buffer（with MgCl2）2.5 μL，Taq酶0.5 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)步驟：95 ℃下預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃下延伸30 s，重復(fù)10個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán);72 ℃下修復(fù)延伸5～8 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，經(jīng)0.5 μg·mL-1的溴化乙錠染色，調(diào)節(jié)電壓120 V，電泳30 min，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察和拍照。

1.3.4 SSR數(shù)據(jù)分析

利用Popgen 32軟件檢測等位基因數(shù)（Na）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Shannon‘s多樣性信息指數(shù)（I）等遺傳多樣性參數(shù)[14-15]，比較分析賀蘭山東麓葡萄霜霉菌的遺傳多樣性關(guān)系，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類分析圖。

PIC值的計(jì)算方法為1減去所有等位基因頻率的平方的總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳多樣性

利用D3390-01試劑盒提取的DNA完全滿足PCR反應(yīng)的需要，且篩選出的8對SSR特異性引物均可擴(kuò)增出單一明亮條帶，無雜質(zhì)或引物二聚體影響，多態(tài)性、穩(wěn)定性較好，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

為了了解賀蘭山東麓葡萄霜霉病菌的種群結(jié)構(gòu)并推斷其遺傳多樣性，利用Popgen 32軟件對遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行檢測。雜合度反映了群體在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的遺傳變異狀態(tài)，群體遺傳多態(tài)性的均勻度的度量常采用雜合度作為參數(shù)，觀察雜合度和期望雜合度越接近，品系受外源選擇和近親繁殖的影響較小，群體處于遺傳平衡狀態(tài)。

使用的8對SSR引物在19個(gè)樣品中的多態(tài)等位基因數(shù)（Na）數(shù)量范圍在2～5之間，獲得27個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)為3.38（表3）。其中：PV138擴(kuò)增出的等位基因最多，有5個(gè)等位基因;引物PV93擴(kuò)增出的等位基因最少，有2個(gè)等位基因。Shannon’s多樣性指數(shù)（I）的最大變異值為0.961 5（PV14），最小變異值為0.334 2（PV65），整個(gè)群體的平均I值為0.674 8。引物的多態(tài)信息含量（PIC）范圍在0.145 0～0.477 6之間，平均PIC為0.335 5。SSR位點(diǎn)的觀察雜合度Ho最低為0.080 0（PV65），最高為0.947 4（PV61），平均Ho為0.448 1;SSR位點(diǎn)的期望雜合度He最低為0.153 5（PV65），最高為0.584 6（PV14），平均He為0.394 0。其中：ISA、PV65和PV138引物的觀察雜合度Ho低于期望雜合度He，其余引物的觀察雜合度均高于期望雜合度，表明供試菌株之間的雜合度較好，具有良好的遺傳多樣性。

2.2 SSR分子標(biāo)記的聚類分析

遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果表明：供試19份材料間存在遺傳變異現(xiàn)象。群體間的遺傳相似系數(shù)（GS）變異范圍在0.64～0.97之間。

遺傳相似系數(shù)聚類分析結(jié)果如下：19份材料在相似系數(shù)0.645處聚為第2類。在相似系數(shù)0.708處，19份材料分為3類;其中：第1類包含了1份材料，菌株編號為YLC-DQ，來自園林場資源圃的大青，說明該菌株與其他菌株間的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn);第2類包括了2份材料，菌株編號為YM-MLZ（御馬酒莊的梅鹿輒）、YHJZ-CXZ（禹皇酒莊的赤霞珠），兩者均來自青銅峽產(chǎn)區(qū)，說明遺傳差異最小，親緣關(guān)系較近;第3類包含了16份材料，菌株編號為ZQT-CXZ、JS-HDQ、HD-XDL、HD-CXZ、LL-HDQ、HYT-CXZ、PvGCZ-CXZ、YR-XDL、YR-MSL、Y4-CXZ、PY-XDL、YLC-XDL、DDT-SLZ、DDT-CXZ、SYC-HDQ、CH-

MEDW，菌株分別來自永寧、大武口、青銅峽、紅寺堡、園林場、賀蘭金山的赤霞珠、霞多麗、馬瑟蘭、紅地球、蛇龍珠、摩爾多瓦，說明這6個(gè)品種之間的差異都比較小，親緣關(guān)系較近。

3 結(jié)論與討論

葡萄霜霉病菌可隨幼苗傳播，且其品種來源較多。20世紀(jì)80年代，寧夏在賀蘭山東麓大面積引種葡萄成功，種苗大多源自國外進(jìn)口，這很可能引入了國外的菌源。此外，賀蘭山東麓區(qū)域地形波動(dòng)較大，形成多個(gè)小氣候帶，且各區(qū)域氣候獨(dú)特，導(dǎo)致同一葡萄品種在不同區(qū)域的發(fā)病情況也有所差異。同時(shí)，種條和苗木的頻繁運(yùn)輸也可能導(dǎo)致葡萄霜霉病菌遺傳多樣性隨著其寄主品種的進(jìn)化和復(fù)雜生態(tài)環(huán)境的變化而不斷變化。除環(huán)境氣候條件、葡萄園管理水平等因素外，還有可能是不同小產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌分化或變異造成的，特別是對于這種地理分布廣泛的病原菌而言，種內(nèi)致病力分化的可能性更大。

在本試驗(yàn)中也曾嘗試單細(xì)胞挑?。╩icromanipulator method）來獲取葡萄霜霉病菌菌株的純培養(yǎng)，但由于單個(gè)孢子囊在寄主上的萌發(fā)率極低，這種方式獲得的少量純化菌株需要擴(kuò)繁以滿足DNA提取的需要。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葡萄霜霉病菌經(jīng)多次擴(kuò)繁后，葡萄霜霉病菌的產(chǎn)孢量下降，表現(xiàn)為葡萄葉片上的白色霉菌層在顯微鏡下菌絲多見，孢子囊少見。雖然純化菌株對于葡萄霜霉病菌的研究非常重要，但對于大量的野生葡萄霜霉病菌，只能選擇未經(jīng)單細(xì)胞純化過的菌株來提取DNA。

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，揭示了賀蘭山東麓不同產(chǎn)區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳分化現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)其親緣關(guān)系和地理分布有一定的相關(guān)性。由于本研究中葡萄霜霉病菌的采樣點(diǎn)和每個(gè)采樣點(diǎn)菌株數(shù)量有限，葡萄霜霉病菌的傳播途徑和遺傳結(jié)構(gòu)無法明確。因此，為了深入闡明賀蘭山東麓葡萄霜霉病菌的遺傳結(jié)構(gòu)，有必要全方位收集菌株樣本。在今后的研究中，應(yīng)增加菌株的取樣量和取樣面積，以更好地闡明葡萄霜霉病菌流行菌群和傳播途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 厚正芳，吳正強(qiáng). 寧夏葡萄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢研討[J]. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2017，37（24）：150，168.

[2] 劉松濤，李茜，呂雯，等. 中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢——以寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)業(yè)為例[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2019（9）：241-243.

[3] 王忠躍. 葡萄健康栽培與病蟲害防控[M]. 北京：中國

農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2017.

[4] WONG F P， BURR H N， WILCOX W F. Heterothallism in plasmopara viticola[J]. Plant Pathology， 2001， 50（4）：

427-432.

[5] GOBBIN D， JERMINI M， LOSKILL B， et al. Importance of secondary inoculum of Plasmopara viticola to epidemics of grapevine downy mildew[J]. Plant Pathology， 2005， 54

（4）： 522-534.

[6] HAWKINS N J， FRAAIJE B A. Fitness penalties in the evolution of fungicide resistance[J]. Annual Review of Phytopathology， 2018， 56（1）： 339-360.

[7] 崔萍，李甲貴，穆海彬，等. 寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展建議[J]. 中國果樹，2023（4）：122-125.

[8] 楊璐嘉，初炳瑤，鄧杰，等. 寧夏葡萄霜霉病菌致病型鑒定及葡萄品種抗性評價(jià)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2020，47（6）：1321-1332.

[9] 王慶軍，朱薇，王躍華，等. 分子標(biāo)記在葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中國果樹，2023（7）：15-20.

[10] 石潔. 葡萄霜霉病菌與寄主品種相關(guān)的遺傳分化研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2016.

[11] 王境楊，張昊，孔繁芳，等. 云南省葡萄霜霉病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的SSR分析[J]. 植物保護(hù)，2023，49（2）：170-175，226.

[12] GOBBIN D， PERTOT I， GESSLER C. Identification of microsatellite markers for Plasmopara viticola and establishment of high throughput method for SSR analysis[J]. European Journal of Plant Pathology， 2003， 109（2）： 153-164.

[13] ROUXEL M， PAPURA D， NOGUEIRA M， et al. Virginie microsatellite markers for characterization of native and introduced populations of Plasmopara viticola， the causal agent of grapevine downy mildew[J]. Applied Environmental Microbiology， 2012， 78（17）： 6337-6340.

[14] 周婷婷. 新疆地區(qū)葡萄霜霉病菌致病性分化研究[D]. 石河子：石河子大學(xué)，2015.

[15] 李卓. 新疆葡萄霜霉病菌孢子囊的萌發(fā)、侵染及遺傳分化的研究[D]. 石河子：石河子大學(xué)，2017.

責(zé)任編輯：周慧