牟 楊，楊志文

重慶大學(xué)附屬涪陵醫(yī)院 1.康復(fù)醫(yī)學(xué)科；2.急診醫(yī)學(xué)部，重慶 408099

急性期重癥腦損傷患者鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物選擇尚未達成共識,68% ～76%存在不恰當(dāng)?shù)纳铈?zhèn)靜,導(dǎo)致神經(jīng)損傷加重,譫妄發(fā)生率和病死率增加[1]。

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)可能是一個突破口,它兼具鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮及鎮(zhèn)痛療效。已有動物實驗表明DEX通過抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,有明確的神經(jīng)保護作用,但一直未能明確其細胞內(nèi)機制,大大限制了DEX的臨床推廣應(yīng)用。

軸突局部線粒體動力學(xué)(即線粒體分裂和融合)及線粒體軸突轉(zhuǎn)運(mitochondrial axonal tran-sport, MAT)障礙是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)過度釋放的“觸發(fā)點”。腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate activates protein kinase,AMPK)是調(diào)節(jié)該“觸發(fā)點”的關(guān)鍵信號蛋白,而DEX可激活A(yù)MPK信號通路[3],為確定DEX對受損細胞神經(jīng)保護作用是否是通過激活A(yù)MPK實現(xiàn)的,觀察了AMPK抑制劑compound C可否逆轉(zhuǎn)DEX的神經(jīng)保護作用。

因此,本研究通過建立腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞模型,從線粒體角度探尋DEX產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的細胞內(nèi)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人成神經(jīng)細胞瘤細胞系SH-SY5Y(ATCC公司);抗KIF5B抗體(Cell Signaling公司);右美托咪定(DEX)、compound C(CC)、anti-OPA1、TNF-α(Sigma-Aldrich公司); 抗(anti-)p-AMPK、 anti-SNPH、anti-Drp1(Abcam公司);BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒、線粒體電位檢測試劑盒、活性氧含量測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 確定最佳TNF-α、DEX劑量:檢測細胞系支原體污染,添加ATRA(10 nmol/L)分化6 d后,將細胞用于后續(xù)實驗。于6孔板內(nèi)接種細胞,待細胞培養(yǎng)至50%～70%匯合后,加10、20、50、100 ng/mL TNF-α,24 h后, CCK8比色法檢測細胞存活率,將細胞存活率約為50%時TNF-α的劑量確定為后續(xù)實驗中使用濃度。待TNF-α誘導(dǎo)的SH-SY5Y損傷細胞模型建立成功后,加10,20,50,100 nmol/L DEX,24 h后, CCK8比色法檢測細胞存活率,將細胞存活率約為50%時 DEX的劑量確定為后續(xù)實驗中使用濃度。

1.2.2 細胞的分組及處理:將細胞分為對照組(control)、TNF-α損傷細胞模型組(model,20 ng/mL,24 h)、DEX干預(yù)模型組(DEX,10 nmol/L,24 h)、DEX聯(lián)合compound C干預(yù)模型組[DEX+CC(10 μmol/L)]4組。

1.2.3 Western blot檢測細胞中p-AMPK、SNHP、KIF5B、Drp1、OPA1的表達:提細胞蛋白質(zhì)并通過BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。用 12% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h,分別加入p-AMPK、SNHP、KIF5B、Drp1、OPA1抗體于4 ℃過夜,室溫下與人抗兔 IgG 孵育 1 h,化學(xué)發(fā)光試劑顯影。用Image J 進行圖像分析。

1.2.4 ELISA檢測細胞中IL-1β和IL-6含量:根據(jù)試劑盒進行包被封閉、加樣、孵育、顯色,450 nm處測定光吸度值,在蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算炎性因子的含量。

1.2.5 用JC-1檢測細胞線粒體膜電位(Δψm):將細胞接種在48孔板中,分別每孔滴加150 μL 10 μmol/L JC-1染料后,將48孔板放置于CO2細胞培養(yǎng)箱中,孵育30 min,后用JC-1染色;將48孔板放置在熒光顯微鏡下觀察并留圖。設(shè)定發(fā)射波長分別為590 nm、530 nm,測量并分析紅、綠色熒光強度比。

1.2.6 用微孔板免疫捕獲測定試劑盒檢測細胞線粒體功能:按線粒體分離試劑盒說明書從細胞中分離線粒體。將線粒體勻漿加入相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液中。轉(zhuǎn)移到預(yù)熱過的(30 ℃)石英比色皿中,complex Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別在450、600、550 和550 nm處測定吸光度,并在蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)化后,complex Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性以mA/min·mg protein表示。

1.2.7 用相應(yīng)試劑盒檢測細胞ATP、氧化指數(shù):用比色法試劑盒檢測總ATP水平(在570 nm處),并以μmol/mg蛋白為單位表示結(jié)果。按試劑盒測定細胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量。

1.2.8 用DCFH檢測細胞內(nèi)ROS水平:將細胞接種在48孔板,每孔滴加200 μL內(nèi)含10 μmol/L DCFH和活細胞染色劑的混合液后, 放置于CO2細胞培養(yǎng)箱中,避光孵育20 min后洗滌;通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光強度,設(shè)定激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為488 nm、525 nm。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實驗確定TNF-α和DEX最佳劑量

與對照組相比,模型組SH-SY5Y細胞存活率以劑量依賴性方式顯著降低(P<0.001)(圖1A),20 ng/mL處理24 h后,細胞存活率約 50%(P<0.001)(圖1B),在后續(xù)實驗中使用此劑量及時間點。隨后,DEX(10～100 nmol/L)預(yù)處理 24 h后,與模型組相比,DEX 干預(yù)模型組(10～100 nmol/L)細胞存活率提高(P<0.001)(圖1B),從患者獲得DEX 血漿有效濃度為0.22～2.50 μg/L,對應(yīng)濃度1.09～12.48 nmol/L,因此,后續(xù)實驗中使用10 nmol/L DEX。

A,B.SH-SY5Y cells were treated with different concentrations of TNF-α and DEX. Cell viability was measured by MTT assay to determine the optimal dose; *P<0.001 compared with control group;# P<0.001 compared with model group;△ P<0.001 compared with DEX group.

2.2 DEX 減輕細胞線粒體功能損害、減少氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)

Model組較contol組complex Ⅰ～Ⅳ、ATP、GSH水平(P<0.001)(圖2A～E,G), 和SOD (P<0.01)(圖2H)水平顯著降低,但MDA及IL-1β、IL-6水平顯著增高(P<0.001)(圖2F,I,J),DEX組較model組complex Ⅰ～Ⅳ及ATP、GSH、SOD水平顯著增高,而MDA、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.001)(圖2A-J);DEX+CC組較DEX組complex Ⅰ～Ⅳ及ATP、GSH(P<0.01)(圖2A～G)、SOD(P<0.001)(圖2H)水平顯著降低,而MDA、IL-1β、IL-6水平顯著增高(P<0.01)(圖2F,I～G)。

A-D.level of respiratory chain complex Ⅰ-Ⅳ detected by immunocapture assay; E.level of ATP;F.level of MDA;G.level of GSH;H.level of SOD; I.IL-6 content; J.IL-1β content; *P<0.01,**P<0.001 compared with control group;# P<0.001 compared with model group;△ P<0.01,△ △ P<0.001 compared with DEX group.

A.mitochondrial membrane potential(Δψm) was detected by JC-1 probe staining; B.quantitative analysis of Δψm; *P<0.001 compared with control group;# P<0.001 compared with model group;△ P<0.01 compared with DEX group.

A.ROS assay detected by DCFH staining; B.quantitative analysis of DCFH staining; *P<0.001 compared with control group;# P<0.001 compared with model group;△ P<0.01 compared with DEX group.

2.3 DEX增加了模型組細胞中Δψm

Model組較contol組Δψm水平顯著下降,DEX組較model組Δψm水平顯著增高,DEX+CC組較DEX組Δψm水平顯著降低(P<0.001)(圖3A,B)。

2.4 DEX抑制了模型組細胞中ROS積累

Model組較contol組ROS水平顯著增高,DEX組較model組ROS水平顯著降低(P<0.001)(圖4A,B),DEX+CC組較DEX組ROS水平顯著增高(P<0.01)(圖4A,B)。

2.5 DEX 可激活模型組細胞p-AMPK,上調(diào)OPA1和SNPH的表達,抑制Drp1和KIF5B的表達

Model組較contol組p-AMPK、SNPH及OPA1水平顯著降低,而Drp1和KIF5B水平顯著增高,DEX組較model組p-AMPK、SNPH及OPA1水平顯著增高,而Drp1和KIF5B水平顯著降低(P<0.001)(圖5A～F),DEX+CC組較DEX組p-AMPK、SNPH(P<0.001)(圖5A～F)及OPA1(P<0.01)(圖5F)水平顯著降低,而Drp1和KIF5B水平顯著增高(P<0.001)(圖5A～F)。

*P<0.001 compared with control group;# P<0.001 compared with model group;△ P<0.01,△ △ P<0.001 compared with DEX group.

3 討論

TNF-α是重癥顱腦損傷后導(dǎo)致神經(jīng)炎性反應(yīng)和線粒體功能障礙的重要細胞因子。本研究通過建立TNF-α誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞損傷模型,觀察DEX對細胞損傷模型作用及其機制。發(fā)現(xiàn)DEX通過提高線粒體膜電位、呼吸鏈復(fù)合酶活性,促進ATP生成、抑制ROS產(chǎn)生等方面抑制TNF-α誘導(dǎo)的的線粒體功能降低,保護神經(jīng)功能。

有研究表明,AMPK通過調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激,保護線粒體功能,抑制神經(jīng)退行性變[4]。AMPK激活降低神經(jīng)元介導(dǎo)的炎性因子水平[5],本研究發(fā)現(xiàn)DEX提高損傷模型細胞p-AMPK水平,與報道一致。同時發(fā)現(xiàn)AMPK激活是DEX產(chǎn)生抗傷害性保護作用的中心機制,AMPK抑制劑Compound C可逆轉(zhuǎn)DEX對損傷細胞模型神經(jīng)損傷的緩解,與報道一致[6]。

AMPK是線粒體動態(tài)平衡的關(guān)鍵調(diào)控因子[7]。而線粒體動力學(xué)(mitochondrial dynamics)及線粒體軸突運輸(mitochondrial axonal transport, MAT)是[8]是正常細胞維持線粒體動態(tài)的關(guān)鍵[9]。因此,本研究假設(shè)激活A(yù)MPK可改善受損線粒體動力學(xué),恢復(fù)局部能量供應(yīng),減少異常MAT,從而保護線粒體功能和抗氧化應(yīng)激。

檢測MAT主要調(diào)節(jié)蛋白——線粒體錨定蛋白SNPH和線粒體正向移動蛋白KIF5B的表達,發(fā)現(xiàn)DEX下調(diào)KIF5B表達,上調(diào)SNPH表達。有研究發(fā)現(xiàn)SNPH通過激活A(yù)MPK介導(dǎo)線粒體錨定作用,AMPK和SNPH的表達正相關(guān)[10]。SNPH通過與KIF5B結(jié)合介導(dǎo)線粒體活性依賴的固定,而AMPK磷酸化KIF5B并抑制線粒體向前運輸。KIF5B表達減少導(dǎo)致線粒體正向轉(zhuǎn)運減少,而SNPH的表達則會增加[11]。 在癌模型[12]中,SNPH降低導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加、細胞增殖降低和細胞線粒體運動增強。本研究假設(shè)和實驗結(jié)果與上述報道一致:激活A(yù)MPK可通過下調(diào)KIF5B、上調(diào)SNPH來降低MAT,實現(xiàn)線粒體原位復(fù)能和抗氧化應(yīng)激。

進一步檢測線粒體動力學(xué)主要調(diào)節(jié)蛋白:裂變蛋白Drp1和融合蛋白OPA1的表達,發(fā)現(xiàn)DEX下調(diào)Drp1表達,上調(diào)OPA1表達,與報道一致[13]。

鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜在急性期重癥腦損傷患者治療中起著至關(guān)重要的作用,但目前臨床上鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜藥物多存在神經(jīng)損傷作用。本研究顯示,右美托嘧啶可能通過AMPK介導(dǎo)的抑制異常線粒體動力學(xué),促進線粒體原位融合復(fù)能,對損傷神經(jīng)細胞具有保護作用,可為急性期重癥腦損傷患者鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜治療提供更多思路。