劉永政 劉曉靜 王俊俠 劉平原 劉淑華

(秦皇島市第一醫(yī)院心內(nèi)科,河北 秦皇島 066000)

缺血性心臟病是心血管疾病死亡的重要原因,治療手段目前主要是恢復(fù)缺血區(qū)心肌的血液供應(yīng),但血管再通后常出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷,而再灌注損傷會(huì)伴隨心肌細(xì)胞的凋亡和壞死〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)〔2〕,心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制涉及氧自由基生成過(guò)多、炎性反應(yīng)等。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路能通過(guò)感應(yīng)集體能量及氧化應(yīng)激狀態(tài)來(lái)在能量代謝中發(fā)揮出重要作用,調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),也參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)和氧化應(yīng)激損傷的過(guò)程〔3〕。白楊素屬于黃酮類(lèi)化合物的一種,具有抑制病態(tài)血管生成的作用〔4〕。研究報(bào)道〔5〕,其對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有治療作用。但白楊素對(duì)心肌缺血再灌注損傷時(shí)對(duì)SIRT1/AMPK信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控的研究國(guó)內(nèi)還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道,本研究探討白楊素調(diào)控SIRT1/AMPK信號(hào)通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷老年大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 研究動(dòng)物:選取SPF級(jí)SD老年雄性大鼠30只,均為12～24月齡;體質(zhì)量300～350 g,平均(337.12±10.46)g。SPF級(jí)SD老年雄性大鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2020-0049。大鼠均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)中心的要求及規(guī)定來(lái)對(duì)老年大鼠進(jìn)行嚴(yán)格的處置。整體環(huán)境:飼養(yǎng)環(huán)境22～25 ℃,平均(24.07±0.81)℃;相對(duì)濕度42%～67%,均由統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)中心專(zhuān)業(yè)人員來(lái)進(jìn)行管理和飼養(yǎng),飼養(yǎng)過(guò)程中,每天均需要進(jìn)行10～12 h光照,飼養(yǎng)過(guò)程中需滿(mǎn)足老年大鼠的日常飲水、飲食情況,從而對(duì)大鼠自身健康狀態(tài)進(jìn)行維持,行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。主要試劑、儀器:白楊素98%(上海純優(yōu)生物科技有限公司,批號(hào):180724)。白細(xì)胞介素(IL)-1β試劑盒(上海欽誠(chéng)生物科技有限公司);前列地爾注射液(西安力邦制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20103101);肌酸激酶(CK,上海西唐生物科技有限公司);CK-同工酶(MB,上海梵態(tài)生物科技有限公司);肌鈣蛋白(cTn)I(上海白益生物科技有限公司);丙二醛(MDA,深圳海思安生物技術(shù)有限公司);超氧化物歧化酶(SOD,上海機(jī)純實(shí)業(yè)有限公司);活性氧(ROS,上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司);核糖核酸(RNA)提取試劑盒(上海瓦蘭生物科技有限公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(江蘇天凈沙基因診斷技術(shù)有限公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物設(shè)計(jì)及合成(上海卓強(qiáng)生物科技有限公司);鼠抗兔SIRT1、AMPK(上海圻明生物科技有限公司);多功能酶標(biāo)儀(上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司;型號(hào):SpectraMAX M2);離心機(jī)(廣州科適特科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):LSE TM);光學(xué)顯微鏡〔中輝徠博(北京)儀器有限公司,型號(hào):DM3000-DM3000〕;RIPA裂解液(浙江羽翔生物科技有限公司);蛋白電泳儀(武漢時(shí)勝生物科技有限公司;型號(hào):VP-1801)。

1.2分組與建模 將30只老年大鼠選取5只作為空白組,不做任何處理,進(jìn)行正常喂養(yǎng)。其余25只老年大鼠參照羅斌等〔6〕研究心肌缺血再灌注損傷的造模方法來(lái)進(jìn)行造模。首先,在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行開(kāi)始前,對(duì)老年大鼠進(jìn)行12 h禁水、禁食,隨后對(duì)25只大鼠進(jìn)行1% 5 ml/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,待麻醉生效后將老年大鼠固定于解剖板,連接動(dòng)物呼吸機(jī)來(lái)檢測(cè)老年大鼠的心電圖情況。將大鼠胸左側(cè)第三和第四肋骨之間進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù),對(duì)其包膜進(jìn)行分離后將心臟進(jìn)行充分暴露,剪開(kāi)心包膜,在平左心耳下緣1.0～1.5 mm位置使用無(wú)損傷縫線(xiàn)進(jìn)行進(jìn)針,從左前降支后進(jìn)行出針,進(jìn)行結(jié)扎手術(shù),通過(guò)肉眼觀(guān)察左心室情況,發(fā)現(xiàn)左心室存在顯著蒼白,與此同時(shí)心電圖監(jiān)測(cè)結(jié)果ST段抬高達(dá)到缺血的目的。在進(jìn)行結(jié)扎30 min后,恢復(fù)血供2 h內(nèi),其心肌缺血再灌注損傷模型造模成功。在造模過(guò)程中死亡7只,將其余18只老年大鼠分別分為模型組(6只)、藥物對(duì)照組(6只)、白楊素組(6只)。

1.3給藥干預(yù) 按參照文獻(xiàn)〔7〕給藥,白楊素組給予白楊素20 mg/kg灌胃(以白楊素量計(jì)算),1次/d,持續(xù)14 d;藥物對(duì)照組給予8 μg/kg前列地爾注射液進(jìn)行治療,在進(jìn)行最后1 d治療后將所有大鼠處死,收集大鼠心肌組織、血液樣本,來(lái)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)水平的檢測(cè)。空白組及模型組均灌注同等劑量的生理鹽水。

1.4心肌酶學(xué)指標(biāo)、氧化及抗氧化水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS水平。將采集的老年大鼠血液樣本通過(guò)離心機(jī),以4 000 r/min、離心半徑9 cm,進(jìn)行10 min離心處理,提取上清液。具體方法步驟:首先,將CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS標(biāo)準(zhǔn)品稀釋,倒入EP管,后加入CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS標(biāo)準(zhǔn)品,混勻,后將其倒入空白孔中,室溫下孵育55 min,在孔中加入洗滌緩沖液,重復(fù)清洗,后加入51 μl的CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS抗體,室溫下孵育1 h,加入洗滌緩沖液,重復(fù)清洗,加入102 μl SP結(jié)合液,封孔,室溫下孵育45 min,加入洗滌緩沖液,重復(fù)清洗,后加入87 μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液,570 nm下測(cè)定光密度(OD)值,測(cè)出CK、CK-MB、cTnI、MDA、SOD、ROS水平。

1.5SIRT1、AMPK mRNA表達(dá) 采用反轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR法測(cè)定SIRT1、AMPK mRNA表達(dá),采用SIRT1 mRNA試劑盒(廣州威佳科技有限公司)、AMPK mRNA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)提取血液內(nèi)RNA,用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),將cDNA,產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。條件參數(shù)為預(yù)火80 ℃預(yù)變性7 s,取出降溫至75℃,變性4 s,迅速降溫至55 ℃,退火13 s,溫度保持48 ℃,延伸43 s,26個(gè)循環(huán),重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′,下游:5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′;SIRT1上游引物:5′-GCTCGCCTTGCTGTGGACTTC-3′,下游:5′-GTGACACAGAGATGGCTGGAACTG-3′;AMPK上游引物:5′-TTGCGTGTGCGAAGGAAGAACC-3′,下游:5′-CCG ATCTCTGTGGAGTAGCAGTCC-3′。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算SIRT1、AMPK mRNA表達(dá)量。

1.6SIRT1、AMPK蛋白表達(dá) 采用Western印跡檢測(cè)老年大鼠骨組織中SIRT1、AMPK蛋白表達(dá)量。取出低溫保存的心肌組織,進(jìn)行生理鹽水沖洗,沖洗干凈后進(jìn)行組織切片(切片厚度為2 μm),完成切片后,采用裂解液溶解心肌組織切片,進(jìn)行組織勻漿制作。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對(duì)SIRT1、AMPK蛋白量進(jìn)行檢測(cè),提取等量蛋白質(zhì),隨后置于高溫1 600 ℃中進(jìn)行5 min變性處理。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)于每孔加入52 μg蛋白后進(jìn)行,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉,常溫下對(duì)SIRT1、AMPK二抗(1∶1 000)置于搖床上進(jìn)行孵育,共進(jìn)行2 h孵育,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算SIRT1、AMPK蛋白表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌酶學(xué)指標(biāo)水平比較 如表1所示,白楊素組CK、CK-MB、cTnI水平高于空白組,低于模型組、藥物對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組心肌酶學(xué)指標(biāo)水平、氧化及抗氧化水平比較

2.2各組氧化及抗氧化水平比較 如表1所示,白楊素組MDA、ROS水平高于空白組,低于模型組、藥物對(duì)照組,SOD水平低于空白組,高于模型組、藥物對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.3各組SIRT1、AMPK mRNA及蛋白表達(dá)對(duì)比 如表2所示,白楊素組SIRT1、AMPK mRNA及蛋白表達(dá)低于空白組,高于模型組、藥物對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組SIRT1、AMPK mRNA及蛋白表達(dá)對(duì)比

3 討 論

CK、CK-MB、cTnI是臨床中對(duì)心肌損傷程度情況進(jìn)行判斷的心肌酶譜相關(guān)指標(biāo)〔8,9〕。正常生理?xiàng)l件下,心肌酶譜相關(guān)指標(biāo)水平普遍呈低表達(dá)狀態(tài),而在發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí),心肌細(xì)胞受損會(huì)出現(xiàn)變性破裂和壞死,致使CK、CK-MB、cTnI水平異常升高〔10～12〕。氧化應(yīng)激也是造成心肌缺血再灌注損傷發(fā)展的關(guān)鍵,主要為組織內(nèi)大量ROS生成,SOD濃度異常降低,導(dǎo)致其線(xiàn)粒體有氧代謝能力出現(xiàn)損傷,破壞自身功能穩(wěn)態(tài)情況,使心肌細(xì)胞出現(xiàn)異常凋亡〔13～15〕。本研究結(jié)果提示,白楊素能夠改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌損傷情況,抑制老年大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)情況,減輕心肌缺血再灌注損傷后氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的損傷情況,提升心肌抗氧化能力。

線(xiàn)粒體是心肌缺血再灌注損傷時(shí)ROS的主要合成處,同時(shí)也是心肌細(xì)胞能量加工場(chǎng)所,缺氧使抗氧化酶活性降低,ROS堆積〔16〕?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),SIRT1是一種Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?；?調(diào)節(jié)糖脂代謝,抑制炎癥和氧化應(yīng)激損傷,與許多心血管病如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血等的發(fā)生密切相關(guān)〔17〕。多種藥物通過(guò)作用于SIRT1來(lái)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體的功能,如白藜蘆醇可以提高SIRT1及線(xiàn)粒體蛋白的表達(dá),降低ROS,保證心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體穩(wěn)定〔18〕。當(dāng)心肌缺血時(shí),信號(hào)通路激活被認(rèn)為是一種內(nèi)源性代償機(jī)制來(lái)保護(hù)心肌免受氧化應(yīng)激和損傷,通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)自噬、氧化應(yīng)激來(lái)減輕心肌缺血,且這些機(jī)制之間相互聯(lián)系和相互作用。SIRT1可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子(NF)-κB、AMPK等信號(hào)通路,發(fā)揮舒張血管、保護(hù)心肌等作用〔19〕。AMPK是能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子,心肌缺血時(shí)可被激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物功能,心肌細(xì)胞中SIRT1能激活A(yù)MPK的上游肝臟激酶(LK)B1使AMPK上升〔20〕。SIRT1/AMPK信號(hào)通路能通過(guò)特異的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝及凋亡,或可以成為治療心肌缺血性心臟疾病的潛在靶點(diǎn)〔21,22〕。相關(guān)研究證實(shí),心肌缺血再灌注后大鼠心肌組織明顯受損,細(xì)胞處于缺血缺氧的應(yīng)激狀態(tài),氧供缺乏,導(dǎo)致體內(nèi)ATP生成不足、AMP含量增加,使AMPK被磷酸化激活〔17〕?；罨腁MPK可作用于多種下游底物,抑制ATP消耗,并啟動(dòng)生成ATP的途徑,以維持機(jī)體能量代謝平衡,增加細(xì)胞內(nèi)依賴(lài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的含量,繼而使SIRT1被激活而發(fā)揮其相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)〔23,24〕。本研究結(jié)果表明,白楊素可通過(guò)改善缺血心肌細(xì)胞ATP的能量代謝,從而保護(hù)受損心肌。在心肌缺血缺氧時(shí),AMPK作為細(xì)胞能量感應(yīng)器,可被迅速磷酸化從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。

綜上,白楊素在心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中能對(duì)SIRT1/AMPK信號(hào)通路進(jìn)行激活,改善心肌損傷,抑制氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)能量代謝,從而發(fā)揮其對(duì)心肌組織的保護(hù)作用。