熊愛(ài)華 齊春麗 王欣 呂俊華

(暨南大學(xué) 1藥學(xué)院,廣東 廣州 510632;2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;3廣東駿豐頻譜股份有限公司)

高尿酸血癥與痛風(fēng)發(fā)生關(guān)系密切,有5%～12%的高尿酸血癥患者可發(fā)展為痛風(fēng)〔1〕。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作是由于高尿酸中的尿酸鈉(MSU)在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織以結(jié)晶形式沉積引起的急性炎癥反應(yīng)〔2,3〕。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的患病率呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢(shì),歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示,西方65歲以上老年人癥狀性痛風(fēng)的患病率達(dá)7%〔4〕。目前痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎主要依賴于藥物治療,但周期長(zhǎng)、安全性差,且副作用大〔5〕。因此尋找有效、安全、適于長(zhǎng)期治療的方法就顯得尤為重要。紅外線又稱紅外輻射,屬于波長(zhǎng)在0.75～1 000.00 μm范圍的電磁波,其具有顯著的熱效應(yīng),可以改善局部血液循環(huán),促進(jìn)腫脹消退,兼具消炎和鎮(zhèn)痛作用〔6,7〕。此外,紅外頻譜在關(guān)節(jié)型銀屑病、產(chǎn)后康復(fù)、玫瑰糠疹、部分慢性病、腰椎間盤(pán)突出等疾病領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用〔8～12〕。本研究探討紅外頻譜照射對(duì)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及環(huán)境 SPF級(jí)SD雄性大鼠42只,平均體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(粵)2013-0020。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室恒溫22 ℃、相對(duì)濕度65%～75%、光照周期12 h。

1.2試劑及儀器 氧嗪酸鉀(純度99%,批號(hào):170606-02,山東中科泰斗化學(xué)有限公司);羧甲基纖維素鈉(純度99.5%,批號(hào):254753,上海賽璐珞廠);腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號(hào):201710)、白細(xì)胞介素(IL)-17a(批號(hào):201710)試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司);尿酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào):20171008,南京建成生物工程研究所);5424R小型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);MULTIFUGE X1R大型冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);GH3000隔水培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司);Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司);MF41制冰機(jī)(意大利Scotsman公司);熒光顯微鏡(日本奧林巴斯),石蠟包埋機(jī)(中國(guó)湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司),手動(dòng)旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)Slfe);足趾儀(PV200,成都泰盟科技有限公司);駿豐頻譜治療保健儀(廣東駿豐頻譜股份有限公司,紅外頻譜波長(zhǎng)范圍為3～25 μm)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d后,稱體質(zhì)量,通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(14只)和造模組(28只)。造模組每天灌胃氧嗪酸鉀(準(zhǔn)確稱取適量的氧嗪酸鉀溶于0.5%羧甲基纖維素鈉,配制2 g/kg的氧嗪酸鉀懸浮液),灌胃容積10 ml/kg;正常對(duì)照組給予等體積的溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)。連續(xù)7 d后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進(jìn)行麻醉,眼眶后靜脈叢取血0.5 ml,靜置2～3 h,4 ℃、7 000 r/min離心15 min取血清測(cè)定尿酸含量。將尿酸含量高于110 μmol/L的大鼠確定為造模成功。

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(14只)、紅外頻譜照射組(14只)。除正常對(duì)照組給予等體積的溶媒(0.5%羧甲基纖維素鈉)外,各組大鼠繼續(xù)每天灌胃氧嗪酸鉀(2 g/kg),灌胃給藥容積10 ml/kg。同時(shí),紅外頻譜照射組每天給予紅外頻譜照射(2檔)40 min,正常對(duì)照組和模型對(duì)照組不需照射。分別于紅外頻譜照射處理30、45 d測(cè)定尿酸含量。此外,45 d時(shí),各組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后仰臥固定,將2.5% MSU 0.2 ml直接注射于模型對(duì)照組和紅外頻譜照射組踝關(guān)節(jié)腔中。注射時(shí)將大鼠右(左)踝關(guān)節(jié)彎曲,捫及兩骨突起,局部消毒后,用注射器自兩骨突之間進(jìn)針,感覺(jué)有空洞感后,注入MSU溶液0.2 ml,以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn),在高尿酸的情況下,制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。正常對(duì)照組右(左)踝關(guān)節(jié)注射等體積的生理鹽水。分別于注射后0、1、4、24 h及3、7 d分別測(cè)量關(guān)節(jié)的腫脹程度,計(jì)算腫脹率和抑制率:腫脹率(%)=(致炎后足跖容積-致炎前足跖容積)/致炎前足跖容積×100%。

注射MSU后繼續(xù)給予氧嗪酸鉀和紅外頻譜照射,于紅外頻譜照射處理至60 d時(shí),末次處理50 min后,3%戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動(dòng)脈取血,靜置2～3 h,以離心力7 000 r/min離心15 min后取上清,血清分裝,-20 ℃保存,用于免疫指標(biāo)測(cè)定。切取各組右踝關(guān)節(jié),在冰盤(pán)上操作,除去關(guān)節(jié)周圍的皮膚、肌肉、筋膜等,浸泡于10%甲醛溶液中。

1.4血清指標(biāo)檢測(cè) 采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定血清尿酸;使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定血清IL-17a和TNF-α水平;具體操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5踝關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查 大鼠踝關(guān)節(jié)浸泡于10%甲醛溶液中2～3 d后,再浸泡在乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液中脫鈣處理。脫鈣液需浸沒(méi)踝關(guān)節(jié)2 cm左右,每天更換脫鈣液,直至完全脫鈣;常規(guī)固定、脫水、包埋、切片、制片,蘇木素-伊紅(HE)染色后,光學(xué)顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)病理學(xué)組織改變。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1紅外頻譜照射對(duì)模型大鼠血清尿酸水平的影響 與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組處理前及處理后30、45、60 d,其血清尿酸水平顯著升高(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,紅外頻譜照射組各時(shí)間點(diǎn)血清尿酸水平略有降低,但差異不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清尿酸水平及血清IL-17a、TNF-α水平比較

2.2紅外頻譜照射對(duì)模型大鼠血清炎性細(xì)胞因子的影響 與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組血清IL-17a和TNF-α水平均顯著升高(P<0.05,P<0.01);與模型對(duì)照組相比,紅外頻譜照射組血清IL-17a水平顯著降低(P<0.05),而TNF-α水平略有降低,但差異不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3紅外頻譜照射對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響 與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組關(guān)節(jié)注射尿酸鈉后1、4、24、36 h及3、7 d內(nèi),其關(guān)節(jié)腫脹程度顯著升高(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,紅外頻譜照射組關(guān)節(jié)腫脹度在1、4、24、36 h內(nèi)無(wú)顯著變化,而在3、7 d均顯著減輕(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組不同時(shí)間關(guān)節(jié)腫脹率比較

2.4紅外頻譜照射對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)病理?yè)p傷的影響 正常對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊,滑膜組織表面光滑,無(wú)充血水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組關(guān)節(jié)滑膜組織表面粗糙、充血水腫,滑膜表層細(xì)胞和滑膜下組織明顯增生,有散在或局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn),軟骨表面粗糙不平,有散在或局灶性的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集在關(guān)節(jié)表面,有軟骨細(xì)胞變性、排列紊亂。紅外頻譜照射組關(guān)節(jié)病理變化減輕,關(guān)節(jié)滑膜表層細(xì)胞輕度或中度增生,有輕度炎性細(xì)胞聚集,軟骨細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞形態(tài)基本正常。見(jiàn)圖1。

圖1 各組關(guān)節(jié)病理(HE染色,×200)

3 討 論

高尿酸血癥是痛風(fēng)的主要原因,由于尿酸增高形成尿石沉積于腎臟和關(guān)節(jié)處,導(dǎo)致腎臟和關(guān)節(jié)出現(xiàn)典型的炎性損傷〔13,14〕。本研究結(jié)果表明,在高尿酸的情況下,局部炎性關(guān)節(jié)損傷形成時(shí),也伴隨著血清炎性細(xì)胞因子的增多。

紅外頻譜對(duì)人體皮膚及皮下組織有一定的穿透能力,其光譜能量被組織吸收后主要引起分子動(dòng)能增加,產(chǎn)生熱效應(yīng),使血管擴(kuò)張、血流加速,可以改善血液循環(huán),消除炎性介質(zhì),促進(jìn)滲出物吸收,達(dá)到消腫止痛的輔助治療效果〔7,15～17〕。本研究中,紅外頻譜照射可以輕度的降低模型大鼠血清尿酸水平,緩解關(guān)節(jié)腫脹程度,改善關(guān)節(jié)滑膜表層細(xì)胞增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生或纖維化等病理變化,抑制血清IL-17a和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的形成,尤其是明顯降低IL-17a水平。

綜上所述,紅外頻譜照射對(duì)高尿酸狀態(tài)下由尿酸鈉誘致的大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎損傷有一定的改善作用,可減輕炎性關(guān)節(jié)腫脹,改善關(guān)節(jié)組織的炎性病理變化,其作用機(jī)制可能與抑制血清炎性細(xì)胞因子的過(guò)量形成有關(guān)。