李冬梅 朱偉民 楊佳梅 種寶貴

(衡水市人民醫(yī)院藥學(xué)部,河北 衡水 053000)

阿爾茨海默病常發(fā)生于老年前期和老年期,是一種神經(jīng)退行性腦部疾病。相比于男性,女性患病率更高,臨床癥狀多為失語、記憶障礙、執(zhí)行能力障礙、行為改變等。該病可能是一組異質(zhì)性疾病,頭部外傷、家族遺傳、病毒感染、生活環(huán)境因素等均可能導(dǎo)致阿爾茨海默病的發(fā)生。尚無特效藥可以治愈該病,一些中醫(yī)治療方法可以緩解癥狀〔1,2〕。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1可以調(diào)控細(xì)胞增殖、生長、凋亡。白細(xì)胞介素(IL)-1β是趨勢(shì)化因子的一員,驅(qū)動(dòng)β-淀粉樣前體蛋白的合成,導(dǎo)致蛋白板塊產(chǎn)生,沉積在腦組織中。IL-6是一種炎癥因子,可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞分化、生長,具有造血功能〔3,4〕。miR-128-3p參與調(diào)控機(jī)體炎癥、氧化應(yīng)激等過程〔5〕。有研究發(fā)現(xiàn),抑制Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB通路可以控制腦皮質(zhì)組織損傷,改善神經(jīng)組織〔6〕。另有研究發(fā)現(xiàn),銀杏葉提取物可改善血液流變性、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心腦血管等〔7〕。本文探究銀杏葉提取物抑制miR-128-3p表達(dá)對(duì)阿爾茨海默病老齡大鼠的干預(yù)效果。

1 對(duì)象與方法

1.1研究動(dòng)物 選取50只20月齡的SPF級(jí)Wistar大鼠,體質(zhì)量315～485 g,由廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(粵)2021-0251,大鼠飼養(yǎng)于相對(duì)濕度為40%～60%,恒溫25 ℃的環(huán)境中。試驗(yàn)操作均參照動(dòng)物試驗(yàn)倫理要求的相關(guān)規(guī)定,且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2分組建模 隨機(jī)選取大鼠10只為正常組,其余40只大鼠參照陳虹茹等〔8〕研究建立阿爾茨海默病模型,正常組給予普通飼料喂養(yǎng),阿爾茨海默病模型鼠給予高脂飼料(脂肪30%,蛋白質(zhì)20%,碳水化合物50%)喂養(yǎng),喂養(yǎng)1 w后每組隨機(jī)抽樣正常和模型鼠各2只,取海馬組織蘇木素-伊紅(HE)染色,發(fā)現(xiàn)模型鼠海馬組織胞體形狀不規(guī)則、出現(xiàn)大量細(xì)胞的核仁固縮為建模成功。建模成功后將阿爾茨海默病模型鼠分為模型組(13只)、低劑量組(12只)、高劑量組(13只)。

1.3給藥干預(yù) 建模分組后開始給藥。低劑量組給予銀杏葉提取物10 mg/kg灌胃,高劑量組給予銀杏葉提取物40 mg/kg灌胃,銀杏葉提取物由上海吉至生化科技有限公司提供(批號(hào):G67840-25 g)。正常組和模型組給予等量的生理鹽水。以上各組均連續(xù)灌胃2 w。

1.4病理形態(tài)學(xué)觀察 采血后取海馬組織進(jìn)行脫水、透明、包埋、制備橫切面石蠟切片,做HE染色,觀察光鏡下海馬組織的病理變化。

1.5TGF-β1、IL-1β、IL-6水平檢測(cè) 取老齡大鼠海馬組織,加入適量(1∶10)組織蛋白抽離液,充分碾碎,離心處理(離心半徑3 cm,轉(zhuǎn)速2 000 r/min,離心時(shí)間15 min),提取上清液,0 ℃保存待測(cè),通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)各組老齡大鼠TGF-β1、IL-1β、IL-6水平進(jìn)行檢測(cè)。試劑盒由博輝生物科技(廣州)有限公司(產(chǎn)品貨號(hào):EK-R36877)提供,重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。

1.6miR-128-3p檢測(cè) 取老齡大鼠海馬組織,采用熒光定量PCR檢測(cè)miR-128-3p,具體步驟按照說明書嚴(yán)格進(jìn)行,試劑盒由武漢益普生物科技有限公司(產(chǎn)品貨號(hào):PPL01655-3a)提供。最后得到組織總RNA,用Nanodrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度,放置-80 ℃保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件:97 ℃預(yù)熱8 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火31 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),采用2-△△Ct方法計(jì)算出miR-128-3p表達(dá)量,miR-128-3p上游引物:5′-AGGCTCACAGTGAACCGGTC-3′,下游:5′-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′,內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

1.7海馬組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白測(cè)定 通過Western印跡對(duì)海馬組織中的TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白TLR4、NF-κB表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),按照12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心,10 min后對(duì)總蛋白定量,取50 μg樣品與上樣緩沖液均勻混合,100 ℃下加熱5 min促使蛋白變性。凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、取膜、封膜,以1∶1 000比例使用0.05%～0.10% TBST稀釋一抗,加入鼠源性一抗(TLR4、NF-κB)后4 ℃孵育過夜,0.05%～0.10% TBST洗膜3次,加入1∶10 000的稀釋羊抗鼠二抗,晃動(dòng)孵育1 h,做0.05%～0.10% TBST洗膜,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,以GAPDH為內(nèi)參照,定量分析蛋白表達(dá)情況。羊抗鼠二抗由深圳市安提生物科技有限公司提供(產(chǎn)品貨號(hào):AT01IgGAb),重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1阿爾茨海默病模型判定及各組海馬組織病理 如圖1所示,造模后病理切片顯示,正常組海馬組織細(xì)胞排列緊密,胞體呈卵圓形,排列有序,基本沒有核仁固縮現(xiàn)象;模型組海馬組織細(xì)胞排列松散,胞體形狀不規(guī)則,出現(xiàn)大量細(xì)胞的核仁固縮,細(xì)胞核明顯減小,空洞較大。低劑量組病變減輕,空洞明顯縮小。高劑量組海馬組織胞核明顯,組織形態(tài)基本正常,空洞較小。

圖1 各組海馬組織病理特征(HE染色,×400)

2.2各組海馬組織TGF-β1、IL-1β、IL-6比較 如表1所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組上述指標(biāo)水平升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組上述指標(biāo)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組TGF-β1、IL-1β、IL-6水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組海馬組織TGF-β1、IL-1β、IL-6比較

2.3各組海馬組織miR-128-3p比較 如表2所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組miR-128-3p水平升高;與模型組相比,低劑量組、高劑量組miR-128-3p水平降低;與低劑量組相比,高劑量組miR-128-3p水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組海馬組織miR-128-3p及TLR4/NF-κB通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4各組海馬組織TLR4/NF-κB通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 如表2、圖2所示,與正常組相比,模型組、低劑量組、高劑量組TLR4、NF-κB表達(dá)量升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與模型組相比,低劑量組、高劑量組上述指標(biāo)表達(dá)量降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);與低劑量組相比,高劑量組上述指標(biāo)表達(dá)量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1～4:正常組、模型組、低劑量組、高劑量組圖2 各組海馬組織TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)

3 討 論

阿爾茨海默病的發(fā)生與年齡相關(guān),病理學(xué)特征包括神經(jīng)元損傷,老年斑及大腦皮質(zhì)細(xì)胞病理變化〔9,10〕。其病因較為復(fù)雜,不是由多個(gè)基因或單個(gè)基因引起,涉及了較多的信號(hào)通路,影響大腦功能、結(jié)構(gòu)連接改變,也稱為“失連接綜合征”。有研究顯示,銀杏葉分離出的提取物具有抗性腦缺血、抗炎性反應(yīng)、抗氧化、降血脂的功能,其作用機(jī)制有待更深的挖掘〔11〕。

TGF-β1對(duì)不同類型的細(xì)胞具有不同活性,可通過相同的受體信號(hào)通路發(fā)揮功能〔12〕。IL-1β可促進(jìn)B細(xì)胞分泌和增殖抗體〔13〕。IL-6主要由B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,是一種多效細(xì)胞因子〔14〕。微小RNA與記憶形成過程中的特定信號(hào)緊密相關(guān),miR-128-3p能調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和神經(jīng)性疼痛,與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)〔15〕。本文研究提示,銀杏葉提取物可以改善腦皮質(zhì)組織氧化應(yīng)激,減輕神經(jīng)功能受損、神經(jīng)炎性反應(yīng)。分析原因:提取物是從干燥的銀杏葉中分離純化的化合物,主要成分有萜類內(nèi)酯和黃酮苷類,具有多靶點(diǎn)抗腦缺血作用,可使海馬谷氨酸遞質(zhì)、線粒體功能改善,從而提高其記憶力。TLR4/NF-κB信號(hào)通路與多種炎癥因子調(diào)控有關(guān),該通路介導(dǎo)了腦缺血神經(jīng)元損傷〔16,17〕。TLR是參與天然免疫的重要蛋白分子,可以識(shí)別并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞答應(yīng)。TLR4可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)損傷、調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞〔18,19〕。NF-κB信號(hào)通路廣泛存在組織細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞的免疫答應(yīng)、炎癥反應(yīng)等過程中起到關(guān)鍵作用,其中NF-κB p65對(duì)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)鍵作用。NF-κB是眾多致病因子釋放的關(guān)鍵,許多細(xì)菌代謝產(chǎn)物和各種表面受體的活化會(huì)激活NF-κB通路〔20,21〕。本研究提示,銀杏葉提取物可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用,防治該疾病,表明TLR4/NF-κB信號(hào)通路與阿爾茨海默病的發(fā)展密切相關(guān)。

綜上,阿爾茨海默病發(fā)生后伴隨著神經(jīng)元損傷、神經(jīng)炎癥反應(yīng)升高等表現(xiàn),經(jīng)過銀杏葉提取物干預(yù)后可以減輕海馬組織病變,減輕腦組織內(nèi)炎性反應(yīng),經(jīng)銀杏葉提取物抑制miR-128-3p后可使阿爾茨海默病臨床癥狀改善,其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。