任思宏 李剛 冉栩 馮周恒

(南充市中心醫(yī)院(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院)麻醉科,四川 南充 637000)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是一種與周圍神經(jīng)功能障礙相關(guān)的慢性糖尿病并發(fā)癥,是引起糖尿病患者致殘的一個(gè)主要原因〔1〕。這種疾病能夠引起糖尿病患者出現(xiàn)灼熱、針扎、蟲爬、觸電等多種疼痛現(xiàn)象,且下肢發(fā)病往往多于上肢,痛感會(huì)隨著糖尿病時(shí)間變長(zhǎng)而有所加重,發(fā)病率也會(huì)相應(yīng)提高〔2,3〕。目前臨床治療DPN引起的疼痛常采用阿米替林、普瑞巴林及離子通道阻斷劑等藥物,然而這些藥物對(duì)DPN疼痛的療效并不顯著〔4〕。熊果酸是存在于女貞子、芭蕉葉、車前草、山楂等植物中的一種重要成分。研究證明,熊果酸及其衍生物具有多種生物功效,如抑菌、抗炎、抗氧化、抗糖尿病等,它能夠提高胰島素敏感度、調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂,對(duì)代謝綜合征及相關(guān)并發(fā)癥有較好的改善和緩解效果〔5,6〕。CXC趨化因子配體(CXCL)12與受體趨化因子CXC基序受體(CXCR)4特異性結(jié)合后,在神經(jīng)病理性疼痛、炎癥痛、癌痛等慢性疼痛中起到重要作用〔7,8〕。本研究探討熊果酸是否能夠通過抑制CXCL12/CXCR4途徑減輕DPN大鼠的疼痛反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0011。

1.2主要試劑與儀器 熊果酸購(gòu)于北京凱詩(shī)源生物科技有限公司(SC11305);鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司(S8050);AMD3100(CXCR4拮抗劑)、兔抗CXCL12、兔抗CXCR4、兔抗β-actin和山羊抗兔IgG購(gòu)于Abcam公司(ab120718、ab25117、ab124824、ab179467、ab205718)。三諾GA-3型血糖儀購(gòu)于上海榕柏生物技術(shù)有限公司(WD-0228);Von Frey纖毛刺激針購(gòu)于上海玉研科學(xué)儀器有限公司;熱痛敏刺激及測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)于意大利Commat公司。

1.3DPN模型構(gòu)建與藥物處理 大鼠適應(yīng)1 w后,隨機(jī)分組:正常組、DPN組、熊果酸低、中、高劑量組、AMD3100組。除正常組給予普通飼料外,其他各組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。大鼠喂養(yǎng)4 w后,禁食12 h,正常組腹腔注射與DPN組相同體積檸檬酸緩沖液,其他各組腹腔注射濃度為1% STZ溶液(STZ溶液使用0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液配制)。注射72 h后,檢測(cè)空腹血糖,血糖濃度≥16.7 mmol/L可認(rèn)為大鼠糖尿病模型構(gòu)建成功。2 w后檢測(cè)糖尿病大鼠機(jī)械痛覺和熱痛覺情況,痛閾降低幅度>20%基礎(chǔ)痛閾的大鼠可認(rèn)為DPN模型構(gòu)建成功〔9〕。DPN模型構(gòu)建完成后進(jìn)行藥物處理,熊果酸低、中、高劑量組分別灌胃15、30、60 mg/kg熊果酸〔10〕,DPN組和正常組灌胃等體積生理鹽水,AMD3100組腹腔注射1 mg/kg AMD3100溶液〔11〕。1次/d,持續(xù)12 w。

1.4大鼠一般情況觀察 觀察并記錄大鼠飲食、飲水、排尿情況,查看大鼠反應(yīng)靈敏度、精神狀態(tài)和毛發(fā)光澤凌亂度等。

1.5大鼠體質(zhì)量及血糖檢測(cè) 大鼠藥物處理前、藥物處理4、8、12 w(即:給藥0、4、8、12 w)分別進(jìn)行體質(zhì)量檢測(cè)和空腹血糖檢測(cè)。

1.6大鼠足底機(jī)械痛閾及熱痛閾值檢測(cè) 給藥0、4、8、12 w,對(duì)大鼠進(jìn)行足底機(jī)械痛閾值和熱痛閾值測(cè)定。將大鼠放置在底部為金屬網(wǎng)的玻璃罩中,檢測(cè)前大鼠進(jìn)行30～60 min環(huán)境適應(yīng)。使用Von Frey纖維絲刺激大鼠足底,記錄大鼠出現(xiàn)明顯縮足反應(yīng)時(shí)閾值,檢測(cè)5次,取平均值作為大鼠機(jī)械痛閾值。使用熱輻射測(cè)痛儀測(cè)定熱痛閾值,經(jīng)熱光束刺激大鼠足底中心,記錄大鼠因熱痛而抬足的反應(yīng)時(shí)間。大鼠每側(cè)足底均測(cè)定5次,每次測(cè)定間隔10 min,取10次平均值作為熱痛閾值。

1.7大鼠坐骨神經(jīng)病理學(xué)觀察 大鼠給藥12 w后處死,取1 cm兩側(cè)坐骨神經(jīng),放入多聚甲醛固定24 h,24 h后經(jīng)沖洗、無水乙醇脫水、石蠟包埋后制成2 μm切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色后,通過光學(xué)顯微鏡觀察坐骨神經(jīng)病理變化。

1.8大鼠脊髓組織中CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)檢測(cè) 大鼠給藥12 w后處死,取脊髓組織使用生理鹽水沖洗后,放入-80 ℃保存。進(jìn)行檢測(cè)時(shí)取出,液氮中研磨后,使用RIPA試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒分別提取總蛋白、檢測(cè)蛋白濃度并計(jì)算蛋白上樣量。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,半干轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上;經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后;分別加入一抗兔抗CXCL12、CXCR4、β-actin(1∶500),4 ℃孵育過夜;加入二抗(1∶5 000),室溫下孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè),Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況 正常組飲食、排尿正常,反應(yīng)靈敏,精神活躍,毛發(fā)順滑有光澤。DPN組飲食、排尿明顯增加,反應(yīng)遲緩,精神萎靡,毛發(fā)雜亂。與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組和AMD3100組精神和行動(dòng)都有改善,飲食和排尿無明顯差異。

2.2各組不同時(shí)間體質(zhì)量和血糖變化 給藥0、4、8、12 w,與正常組比較,DPN組體質(zhì)量明顯下降,空腹血糖明顯升高(P<0.05);與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組體質(zhì)量、空腹血糖無明顯差異(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間體質(zhì)量、空腹血糖變化

2.3各組不同時(shí)間足底機(jī)械痛閾值、熱痛閾值變化 給藥0、4、8、12 w,與正常組比較,DPN組機(jī)械痛閾值和熱痛閾值明顯降低(P<0.05)。給藥4、8、12 w,與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組機(jī)械痛閾值和熱痛閾值明顯升高(P<0.05),且熊果酸對(duì)大鼠機(jī)械痛閾值和熱痛閾值的提高作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05);與熊果酸高劑量組比較,AMD3100組機(jī)械痛閾值和熱痛閾值無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組不同時(shí)間足底機(jī)械、熱痛閾值變化

2.4各組坐骨神經(jīng)病理變化 通過光學(xué)顯微鏡觀察到,正常組坐骨神經(jīng)排列整齊、均勻、緊密,神經(jīng)纖維髓鞘層次清晰、結(jié)構(gòu)有序;DPN組坐骨神經(jīng)明顯排列稀疏混亂、無規(guī)則,神經(jīng)纖維髓鞘寬度增加、分布勻稱度較差,板層排列紊亂、有分離,少量血旺細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死現(xiàn)象;熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組與DPN組比較,上述不良變化獲得一定程度改善,尤其是熊果酸高劑量組和AMD3100組,神經(jīng)排列緊密有序,髓鞘分布均勻。見圖1。

圖1 各組坐骨神經(jīng)病理(HE染色,×400)

2.5各組脊髓組織CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)變化 與正常組比較,DPN組脊髓組織中CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與DPN組比較,熊果酸低、中、高劑量組及AMD3100組CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),且熊果酸對(duì)CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)的抑制作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。AMD3100組與熊果酸高劑量組CXCL12、CXCR4蛋白無明顯差異(P>0.05)。見圖2、表3。

1～5:正常組、DPN組、熊果酸低劑量組、熊果酸中劑量組、熊果酸高劑量組、AMD3100組圖2 各組脊髓組織CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)水平

表3 各組脊髓組織CXCL12、CXCR4蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

DPN疼痛嚴(yán)重影響了患者的正常生活,給患者的身心造成了極大傷害。研究發(fā)現(xiàn)DPN疼痛與糖尿病患者體內(nèi)代謝紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥及微循環(huán)障礙等原因有關(guān)〔12,13〕。目前治療DPN疼痛采用的藥物主要是鎮(zhèn)痛、抗抑郁和抗驚厥類〔14〕,然而這些藥物效果不盡人意。故而尋找更好的治療藥物是現(xiàn)在急需解決的問題。本研究結(jié)果提示,熊果酸能夠減輕或緩解DPN大鼠疼痛反應(yīng),能夠通過改善神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu),抑制大鼠疼痛。另外,熊果酸對(duì)DPN大鼠體質(zhì)量和血糖無明顯影響,這與劉星玥等〔9〕、陳波等〔4〕對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的研究結(jié)果一致。

CXCL12主要來源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,在免疫細(xì)胞生存、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用,CXCR4作為CXCL12特異性受體,參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)功能,在淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞中廣泛表達(dá)〔15,16〕。當(dāng)CXCL12、CXCR4二者特異性結(jié)合時(shí),能夠活化其下游多種信號(hào)通路,如核轉(zhuǎn)錄因子、絲裂原活性蛋白激酶等,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能調(diào)控等方面有重要意義〔17〕。CXCL12結(jié)合CXCR4,一方面可通過活化外周傷害性感覺神經(jīng)元,導(dǎo)致痛覺敏化,另一方面,可通過提高ERK蛋白磷酸化、NLRP3炎癥小體活化等,引發(fā)痛覺敏化,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)疼痛反應(yīng)〔18～20〕。本研究結(jié)果提示,熊果酸可能通過降低CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá),減少CXCL12與CXCR4特異結(jié)合,抑制其活化感覺神經(jīng)元,減弱痛覺敏化。此外,本研究進(jìn)一步表明,熊果酸減輕DPN大鼠疼痛反應(yīng)可能與抑制CXCL12和CXCR4蛋白表達(dá)有關(guān)。