潘慶華 魏文斌 曾莉蓉 朱淑云 譚遠(yuǎn)忠

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院脾胃病科,湖北 恩施 445000)

胃癌是起源于胃黏膜的惡性腫瘤,是全球第四常見的惡性腫瘤,同時也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因〔1,2〕。世界范圍內(nèi)胃癌患者總生存率約為25%,確診時處于疾病晚期、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、高腫瘤內(nèi)異質(zhì)性和化療耐藥性等均可導(dǎo)致患者總體預(yù)后不佳〔3,4〕。手術(shù)聯(lián)合放化療是胃癌的主要治療手段,處于ⅠA和ⅠB期的患者術(shù)后5年生存率為60%～80%,但胃癌早期缺乏特異性癥狀,多數(shù)患者確診時已處于胃癌晚期,可能存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療效果不佳,預(yù)后較差〔5〕。隨著治療方法的進(jìn)步、新輔助治療和靶向藥物的應(yīng)用,胃癌患者預(yù)后得到了一定的改善,但患者總生存率仍不理想,臨床上仍缺乏較為理想的胃癌治療藥物,亟需尋找針對胃癌具有良好療效的治療藥物〔6〕。研究表明,中藥治療胃癌可減輕毒副作用,提高治療效果,緩解化療后的不良反應(yīng),還可健脾祛邪,扶正補(bǔ)虛,有助于抑制胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,改善患者生存狀況〔7〕。白毛夏枯草又名筋骨草,主要化學(xué)成分包括皂苷、黃酮、植物甾酮、環(huán)烯醚萜、生物堿等,可用于治療支氣管炎、急慢性咽炎、扁桃體炎、肺炎、跌打損傷等。藥理研究表明,白毛夏枯草具有調(diào)節(jié)免疫抗腫瘤、抗纖維化、抗菌、抗炎等多種生物學(xué)活性〔8,9〕。研究顯示,白毛夏枯草水提取物可通過抑制肝癌細(xì)胞增生及肝癌血管增殖、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、加速肝癌細(xì)胞分化發(fā)揮抗腫瘤作用〔10〕。目前尚未見白毛夏枯草抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報道,因此本研究旨在觀察白毛夏枯草水提取物對胃癌BGC823細(xì)胞增殖、凋亡的影響,為胃癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器 人胃癌細(xì)胞株BGC823購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,CCK-8試劑盒(貨號:40203ES60)、膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號:40302ES20)均購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體(貨號:ab92536)、兔抗人MMP-9單克隆抗體(貨號:ab76003)、兔抗人凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2單克隆抗體(貨號:ab32124)、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體(貨號:ab32503)、兔抗人髓細(xì)胞白血病因子(Mcl)-1單克隆抗體(貨號:ab32087)、兔抗人剪切的半胱天冬氨酸蛋白酶(Cleaved Caspase)-3單克隆抗體(貨號:ab32042)及兔抗人GAPDH多克隆抗體(貨號:ab9485)均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。流式細(xì)胞儀(型號:Attune NxT)、酶標(biāo)儀(型號:FC)均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2白毛夏枯草水提取物的制備 干燥白毛夏枯草全草5 g,采用蒸餾水進(jìn)行萃取,100 ℃加熱6 h后過濾,濃縮至1 g生藥/ml,過濾除菌后,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 采用含青鏈霉素雙抗混合液及10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌BGC823細(xì)胞,培養(yǎng)條件為95%飽和濕度、5%CO2、37 ℃,每天換液,待細(xì)胞融合度至80%以上時,采用0.25%胰蛋白酶消化,根據(jù)實驗需要傳代。以下實驗均采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4CCK-8法檢測各組細(xì)胞活性 將BGC823細(xì)胞以4×104個/ml接種于96孔板,恒溫培養(yǎng)箱中(5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)24 h后,設(shè)置對照組、實驗組。對照組不加白毛夏枯草水提取物,實驗組分別給藥不同濃度白毛夏枯草水提取物,使其終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml(分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml組),培養(yǎng)48 h,每組設(shè)6個復(fù)孔。向各孔加入10 μl CCK-8及100 μl培養(yǎng)基,培養(yǎng)2 h(5%CO2、37 ℃)。酶標(biāo)儀測量各孔490 nm處吸光值,計算增殖抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集經(jīng)不同濃度白毛夏枯草水提取物處理24 h的BGC823細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次,棄上清,加入Annexin Ⅴ結(jié)合緩沖液制備成細(xì)胞終濃度為1×106個/ml的細(xì)胞懸液并取其中100 μl,加入Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合物5 μl,避光、室溫孵育30 min,加入PI溶液5 μl,避光、室溫孵育10 min,于流式細(xì)胞儀中檢測各組BGC823細(xì)胞凋亡率。重復(fù)3次,取均值。

1.6Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞遷移:將各組BGC823細(xì)胞調(diào)整為1×104個/ml的細(xì)胞懸液,取100 μl加入Transwell小室上室,下室加500 μl含250 g/L胎牛血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h(37 ℃、5%CO2)后,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%結(jié)晶紫染色。細(xì)胞侵襲:于Transwel小室上室(鋪40 μl基質(zhì)膠)中加入500 μl細(xì)胞重懸液,下室加500 μl含250 g/L胎牛血清的培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h,取出上室,多聚甲醛固定下室細(xì)胞15 min,0.5%結(jié)晶紫染色。隨機(jī)選擇5個視野,高倍鏡下觀察各組BGC823細(xì)胞遷移、侵襲情況,記錄穿膜細(xì)胞數(shù),分別記為細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.7Western印跡法檢測MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組BGC823細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。各組分別取50 μg蛋白,行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉(50 g/L)封閉1 h,TBST洗膜,加入相應(yīng)一抗(1∶500)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯影,檢測BGC823細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá),結(jié)果以與內(nèi)參的比值表示,GAPDH為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞增殖的影響 BGC823細(xì)胞增殖抑制率隨白毛夏枯草水提取物濃度的增加顯著升高,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

2.2白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞凋亡的影響 BGC823細(xì)胞凋亡率隨白毛夏枯草水提取物濃度的增加顯著升高,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞凋亡的影響

2.3白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞遷移的影響 BGC823細(xì)胞遷移數(shù)隨白毛夏枯草水提取物濃度的升高而顯著減少,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞侵襲的影響 BGC823細(xì)胞侵襲數(shù)隨白毛夏枯草水提取物濃度的升高而顯著減少,且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1、圖2。

2.5白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)影響 隨著白毛夏枯草水提取物濃度升高,BGC823細(xì)胞MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1蛋白水平依次降低,Bax及Cleaved Caspase-3蛋白水平依次升高,呈顯著濃度依賴性(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 白毛夏枯草水提取物對BGC823細(xì)胞MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax、Mcl-1及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

白毛夏枯草可在多種疾病中發(fā)揮不同作用。研究發(fā)現(xiàn),筋骨草可改善小鼠的氣道炎癥,治療效果隨劑量增多而提高,可能通過調(diào)控腸道菌群、增加擬桿菌數(shù)量,促進(jìn)白細(xì)胞介素-10的釋放發(fā)揮治療作用〔11〕。Zhang等〔12〕研究表明,白毛夏枯草的活性成分能減輕金黃色葡萄球菌引起的肺病理形態(tài)學(xué)損傷,保護(hù)肺血氣屏障,提高金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率,可能通過抑制核因子(NF)-κB信號通路發(fā)揮上述作用。Sawada等〔13〕研究發(fā)現(xiàn),白毛夏枯草提取物可減少兔軟骨中的破骨細(xì)胞數(shù)量,刺激軟骨基質(zhì)再生,可與氨基葡萄糖協(xié)同改善軟骨損傷。姜瓊等〔14〕分析不同白毛夏枯草提取物對肝癌細(xì)胞的作用,結(jié)果顯示,水提取物、乙酸乙酯萃取物及醇提物均可抑制肝癌細(xì)胞增殖,可能通過抑制Bcl-2表達(dá)、促進(jìn)Bax水平發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果顯示,白毛夏枯草水提取物可抑制BGC823細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞凋亡,并抑制BGC823細(xì)胞遷移、侵襲能力,且上述作用隨著白毛夏枯草水提取物濃度的增加而增強(qiáng),與文獻(xiàn)〔5,14〕的研究結(jié)果相似,提示白毛夏枯草水提取物可在胃癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。

MMPs家族可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白成分,影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲,MMP-2、MMP-9是MMPs家族重要的蛋白水解酶,二者在腫瘤新生血管形成、降解基底膜、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮作用〔15〕。Bcl-2、Bax及Mcl-1均為Bcl-2家族蛋白,Bcl-2為抗凋亡基因,Bax及Mcl-1為促凋亡基因,三者均在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用〔16〕。Caspase3為Caspase家族成員,是凋亡過程中的效應(yīng)蛋白,處在Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游,正常情況下Caspase3無活性,Caspase3可被多種刺激信號激活,導(dǎo)致胞核、胞質(zhì)及細(xì)胞骨架的重要蛋白降解失活,細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段〔17〕。本研究結(jié)果顯示,隨著白毛夏枯草水提取物濃度的增加,BGC823細(xì)胞Bax及Cleaved Caspase-3蛋白水平依次升高,MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1蛋白水平依次下降,均呈濃度依賴性,提示白毛夏枯草水提取物可能通過抑制細(xì)胞遷移和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上,白毛夏枯草水提取物可能通過增加Bax、Cleaved Caspase-3水平,降低MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Mcl-1水平,進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗胃癌作用。