賈海燕 張志恒 劉玲

(聊城市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科,山東 聊城 252000)

綜合治療是宮頸癌的主要治療手段,但治療后患者易復(fù)發(fā)且易轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后較差〔1〕。天然植物提取物被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤功能,其可通過調(diào)控基因表達(dá)或信號通路活性從而發(fā)揮抗宮頸癌作用〔2～4〕。白山毛桃根屬于我國傳統(tǒng)中藥,是毛花獼猴桃的干燥根,其具有抗腫瘤的功效。研究表明白山毛桃根提取物可能通過調(diào)控miR-182-5p表達(dá)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲〔5〕。但白山毛桃根提取物是否調(diào)控宮頸癌進(jìn)程還有待探究。miR-135a-5p被發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中高表達(dá),其可以作為促癌基因調(diào)控膀胱癌惡性進(jìn)程〔6〕。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)被激活后可激活下游蛋白激酶B(Akt),Akt磷酸化形成p-Akt從而調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡,抑制PI3K/Akt信號通路活化可抑制宮頸癌細(xì)胞生長〔7〕。但miR-135a-5p是否可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路而參與宮頸癌的發(fā)展尚不清楚。本研究探究白山毛桃根提取物是否通過調(diào)控miR-135a-5p/PI3K/Akt通路而介導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 白山毛桃根,同濟(jì)大學(xué)麗水中藥研究院;HeLa細(xì)胞,武漢Procell;DMEM和胎牛血清,美國Gibco;Lipofectamine3000和TRIzol,美國Invitrogen;反轉(zhuǎn)錄與熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑,日本Takara;噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒,上海碧云天;Transwell小室和基質(zhì)膠,美國Corning; miR-135a-5p模擬物和抑制劑(miR-135a-5p mimics和anti-miR-135a-5p)及陰性對照(miR-NC和anti-miR-NC),廣州銳博生物;兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、p-PI3K、p-Akt和β-actin抗體與山羊抗兔IgG二抗,美國CST。

1.2制備白山毛桃根提取物〔8〕稱取50 g白山毛桃根加入超純水浸泡1 h,煮沸后維持微沸狀態(tài)1 h,過濾,收集藥渣后加入超純水繼續(xù)煮30 min,再次過濾,收集兩次濾液后用旋轉(zhuǎn)揮發(fā)儀蒸發(fā)定容,濃度為0.5 g/ml,用0.22 μm濾器過濾除菌,加入DMEM培養(yǎng)基稀釋濃度為10、20、40 mg/ml。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 HeLa細(xì)胞接種于96孔板(3×103個(gè)/孔),用不同濃度(10、20、40 mg/ml)白山毛桃根提取物處理24 h,分別記為低、中、高劑量組。未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞記為NC組。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-135a-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-135a-5p,記為miR-NC組、miR-135a-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-135a-5p組。HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染anti-miR-NC、anti-miR-135a-5p,用40 mg/ml白山毛桃根提取物處理24 h,分別記為高劑量+anti-miR-NC組、高劑量+anti-miR-135a-5p組。

1.4MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于96孔板,用MTT溶液培養(yǎng)4 h。然后,細(xì)胞與二甲基亞砜(DMSO)孵育5 min,使用酶標(biāo)儀在490 nm檢測各孔吸光度(A)值。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn) 6孔板中每孔加入2 ml 0.6%底層瓊脂糖后凝固,將各組HeLa細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)14 d。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)克隆形成數(shù)。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于預(yù)先包被或不包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室的上室,然后在下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞用多聚甲醛固定和結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下分析侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。

1.7qRT-PCR 用TRIzol從細(xì)胞中提取總RNA,然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。以U6為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-135a-5p相對表達(dá)。

1.8Western印跡 用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,收集裂解細(xì)胞至1.5 ml EP管內(nèi),用超聲破碎儀破碎細(xì)胞,冰上孵育5 min后經(jīng)12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,吸取上清液至新的EP管內(nèi)(蛋白),用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進(jìn)行定量。蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,與anti-MMP2、anti-MMP9、anti-p-PI3K、anti-p-Akt和anti-β-actin孵育。在室溫下與二抗孵育后,用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液曝光成像。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度白山毛桃根提取物對HeLa細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較,低、中、高劑量組細(xì)胞活力和克隆形成數(shù)顯著降低(P<0.05),見圖1、表1。

表1 不同濃度白山毛桃根提取物對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖1 白山毛桃根提取物對HeLa克隆形成影響(結(jié)晶紫染色)

2.2白山毛桃根提取物對HeLa細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與NC組比較,低、中、高劑量組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)及MMP2和MMP9水平顯著下降(P<0.05),見表1、圖2、圖3。

圖2 白山毛桃根提取物對HeLa侵襲和遷移的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

1～10:NC組,低劑量組,中劑量組,高劑量組,miR-NC組,miR-135a-5p組,anti-miR-NC組,anti-miR-135a-5p組,高劑量+anti-miR-NC組,高劑量+anti-miR-135a-5p組圖3 Western印跡檢測各組MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

圖4 miR-135a-5p對各組HeLa克隆形成的影響(結(jié)晶紫染色)

圖5 miR-135a-5p對各組HeLa細(xì)胞侵襲和遷移的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.3白山毛桃根提取物對miR-135a-5p表達(dá)的影響 與NC組(1.00±0.10)比較,低、中、高劑量組miR-135a-5p表達(dá)量(分別為0.81±0.07、0.65±0.05、0.51±0.04)顯著降低(F=84.30,P<0.05)。

2.4miR-135a-5p對HeLa細(xì)胞進(jìn)程的影響 與miR-NC組比較,miR-135a-5p組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)、MMP2、MMP9蛋白水平顯著升高(P<0.05);與anti-miR-NC組比較,anti-miR-135a-5p組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)及MMP2、MMP9蛋白水平顯著下降(P<0.05),見圖3～5、表2。

表2 miR-135a-5p對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5anti-miR-135a-5p可以促進(jìn)白山毛桃根提取物對HeLa增殖、遷移和侵襲的影響 與高劑量+anti-miR-NC組比較,高劑量+anti-miR-135a-5p組細(xì)胞活力、克隆形成數(shù)、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)、MMP2、MMP9蛋白水平顯著降低(P<0.05),見圖3、圖6、圖7、表3。

表3 anti-miR-135a-5p促進(jìn)白山毛桃根提取物對HeLa細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖6 anti-miR-135a-5p促進(jìn)白山毛桃根提取物對HeLa克隆形成的影響(結(jié)晶紫染色)

圖7 anti-miR-135a-5p促進(jìn)白山毛桃根提取物對兩組HeLa細(xì)胞遷移及侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.6各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達(dá) 與NC組比較,高劑量組p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.05);與anti-miR-NC組比較,anti-miR-135a-5p組p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.05);與高劑量+anti-miR-NC組比較,高劑量+anti-miR-135a-5p組p-PI3K、p-Akt蛋白水平顯著降低(P<0.05),見表4、圖8。

表4 各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達(dá)

1～6:NC組、高劑量組、anti-miR-NC組、anti-miR-135a-5p組、高劑量+anti-miR-NC組、高劑量+anti-miR-135a-5p組圖8 Western印跡檢測各組PI3K/Akt蛋白表達(dá)

3 討 論

目前常采用手術(shù)、放化療等綜合治療方式治療宮頸癌,部分患者易產(chǎn)生耐藥性從而降低治療效果,中藥具有毒副作用小且效果好等優(yōu)點(diǎn),已成為抗腫瘤研究的重點(diǎn),研究表明部分中藥可用于治療宮頸癌,但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明〔9〕。miRNA被證實(shí)在宮頸癌中表達(dá)異常,可能作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)〔10,11〕。但中藥是否可以通過調(diào)控miRNA表達(dá)介導(dǎo)宮頸癌進(jìn)程尚需探究。

白山毛桃根提取物可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯等進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔12～14〕。本研究結(jié)果顯示,白山毛桃根提取物可抑制Hela細(xì)胞增殖。MMP2和MMP9與細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)〔15〕。本研究結(jié)果表明,白山毛桃根提取物對宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移有抑制作用。本研究表明,白山毛桃根提取物可能通過減少miR-135a-5p表達(dá)而發(fā)揮抗癌作用。研究顯示,miR-135a-5p高表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移〔16〕。miR-135a-5p可促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移及侵襲〔17〕。miR-135a-5p高表達(dá)可加速結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔18〕。本研究提示,miR-135a-5p在宮頸癌中發(fā)揮促癌作用,還可能作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。PI3K/Akt信號通路活性與細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)〔19,20〕。本研究結(jié)果提示,白山毛桃根提取物可能通過抑制miR-135a-5p表達(dá)而抑制PI3K/Akt信號通路的活化從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲。

綜上,白山毛桃根提取物可通過miR-135a-5p/PI3K/Akt通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。重要的是,本研究顯示miR-135a-5p可能作為白山毛桃根提取物治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn),為宮頸癌治療藥物的開發(fā)提供新方向。