朱振華 左志城 周聚普 趙家舉

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院手足外科,江蘇 蘇州 215000)

股骨骨折是臨床外科常見的損傷,隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進步,大部分的骨折能夠得到較為良好的治療效果,但較長的愈合周期難以避免,且臨床尚不能完全解釋骨折愈合的過程。骨折愈合始于骨折部位骨、骨膜及周圍軟組織的血液積累,在這個過程中機體內(nèi)血小板和死亡或受傷的細胞會釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致血管擴張,引起巨噬細胞、淋巴細胞和破碎的白細胞遷移到此區(qū)域〔1〕。這些細胞也會分泌刺激血管生成的細胞因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)〔2〕。VEGF作為一種重要的細胞因子,具有促進內(nèi)皮細胞增殖、誘導(dǎo)血管生成的作用〔3〕。研究指出,VEGF在骨折愈合過程中發(fā)揮著重要作用〔4〕,而VEGF/蛋白激酶B(Akt)通路在生物機體中能夠促進血管生成與調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)〔5〕,因此可能有助于促進骨折愈合。目前關(guān)于VEGF/Akt通路對于骨折愈合的研究較少,因此本研究通過建立大鼠股骨骨折模型〔6〕,并通過一系列實驗探討VEGF/Akt信號通路在骨折大鼠愈合中的作用及對炎癥因子白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的影響,以期為股骨骨折的愈合提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級SD雄性大鼠30只,6～8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(動物許可證號:44007200041000)。采用標準飼料與飲用水喂養(yǎng),飼養(yǎng)溫度保持在(25±2)℃,相對濕度保持在(40±2)%。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2實驗試劑 p-Akt、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、IL-6、TNF-α抗體及辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);TRIzol Reagent總 RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(美國英杰公司);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(上海生工生物工程股份有限公司);蛋白mark(南京良緯科技有限公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(江蘇碧云天有限公司),慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株(廣州源井生物科技有限公司)。

1.3主要儀器 蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、Bioshine ChemiQ 化學(xué)發(fā)光顯影儀(美國BIO-RAD公司);基因擴增儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司);QPCR儀(美國BIO-RAD公司);電子拉力測試機(英國HOUNSFIELD有限公司)。

1.4模型制備及分組 將30只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組與對照組,每組10只。其中模型組與對照組參照文獻〔6〕步驟,麻醉大鼠后在髕骨內(nèi)側(cè)及股外側(cè)切口置入克氏針固定,隨后用骨折鉗將股骨干中段剪斷以建立大鼠股骨骨折模型,假手術(shù)組不剪斷股骨,其他操作一致。術(shù)后2 d后,將慢病毒轉(zhuǎn)染高表達VEGF的骨髓間充質(zhì)干細胞由尾靜脈移植進對照組體內(nèi)。

1.5四點斷裂實驗 將大鼠股骨組織標本放置于電子拉力測試機上,以5 mm/min對骨折部位進行垂直方向的施壓,直至股骨發(fā)生斷裂,通過內(nèi)置軟件計算各組股骨部位所能承受的最大力、能力及韌性。

1.6酶聯(lián)免疫吸附劑測定實驗 收集各組外周血血清,按照ELISA試劑盒步驟對樣本成骨標記物骨源性堿性磷酸酶(BALP)、IL-6與TNF-α進行標記,測量吸光度后以標準曲線來計算其中BALP、IL-6及TNF-α含量。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色法檢測病理學(xué)變化 將各組股骨組織去除周圍軟組織,在冰冷條件下完成均質(zhì)化,隨后在10%甲醛中進行固定,隨后使用乙二胺四乙酸脫鈣液進行脫鈣,隨后進行包埋,待蠟液出現(xiàn)凝固層后,輕輕放入冷水盆中或冰箱中使其凝固,待石蠟包埋完全凝固后倒出冷縮的蠟塊片,用加熱的外科刀按組織塊位置修整蠟片,然后通過蘇木素染液與伊紅染液進行HE染色步驟。將封好的切片平放于溫箱中,待干燥好后,在熒光倒置顯微鏡的50 μm物鏡下拍照以觀察各組股骨部位的病理狀態(tài)。

1.8實時熒光定量法檢測mRNA表達水平 取大鼠骨痂組織,通過Trizol試劑盒提取總RNA。隨后取制備好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后加入SYBR Green染料與VEGF、p-Akt上下游引物混合離心,隨后于PCR儀上進行擴增,循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號(Ct)值進行相對定量分析。引物序列:VEGF:上游引物5′-GAGCTGTAGAAGATCTTATTC-3′,下游5′-CACAGGCCATCCAAGGCATC-3′;p-Akt:上游引物5′-TTCGCCTTCACTATGGACTACC-3′,下游;5′-GCACGAACAAGCAACTGAACTA-3′;內(nèi)參β-actin上游引物5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′,下游5′-AAAGAAAGG GTGTAAAACGCA-3′。

1.9Western印跡實驗檢測蛋白表達 將各組股骨組織放置于組織研磨器中,加入RIPA 裂解液和苯甲基磺氟(PMSF)蛋白酶抑制劑提取總蛋白,變性后放入-20 ℃冰箱備用。以Western印跡法分別通過電泳、轉(zhuǎn)膜后進行相關(guān)抗體孵育,包括VEGF、p-Akt、IL-6、TNF-α及β-actin等抗體的孵育,孵育完成洗膜后進行相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的鼠抗二抗孵育,最后將含有蛋白標記的膜洗凈,涂上化學(xué)發(fā)光顯影液通過顯影儀拍照,將結(jié)果用ImageJ軟件對其灰度值與β-actin灰度值比較結(jié)果進行系統(tǒng)性處理并分析。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件分析,多組之間比較采用ANOVA分析,兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1過表達VEGF對股骨骨折大鼠股骨力學(xué)參數(shù)的影響 與假手術(shù)組相比,模型組能承受的最大力與組織韌性明顯降低(P<0.05),能量無明顯差異;與模型組相比,對照組能承受的最大力與組織韌性顯著上升(P<0.05),能量無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 3組骨折部位承受的最大力、能量、組織韌性、血清指標及VEGF、p-Akt mRNA水平

2.2過表達VEGF對股骨骨折大鼠血清指標的影響 與假手術(shù)組相比,模型組血清BALP水平顯著降低,IL-6及TNF-α水平顯著上升(P<0.05);與模型組相比,對照組血清BALP水平顯著上升,IL-6及TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3過表達VEGF對股骨骨折大鼠骨痂組織相關(guān)mRNA的影響 與假手術(shù)組相比,模型組骨折部位VEGF、p-Akt mRNA水平顯著降低(P<0.05);與模型組相比,對照組骨折部位VEGF、p-Akt mRNA水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.4過表達VEGF對股骨骨折大鼠骨痂組織病理學(xué)的影響 骨痂組織縱切面染色結(jié)果顯示,模型組骨折部位仍可見透明軟骨組織,且向新骨形態(tài)轉(zhuǎn)化;對照組骨折部位少見透明軟骨組織,能觀察到廣泛的新骨形成。見圖1。

圖1 兩組骨痂組織縱切面病理(HE染色,×50)

2.5過表達VEGF對股骨骨折大鼠骨痂組織相關(guān)蛋白的影響 與假手術(shù)組相比,模型組骨痂組織中p-Akt與eNOS表達量明顯降低,IL-6與TNF-α表達量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,對照組骨痂組織中p-Akt與eNOS表達量顯著上調(diào),IL-6與TNF-α表達量顯著下調(diào)(P>0.05)。見圖2、表2。

圖2 3組骨痂組織中VEGF/Akt信號通路相關(guān)蛋白及炎癥因子表達

表2 3組骨痂組織中VEGF/Akt信號通路相關(guān)蛋白及炎癥因子表達水平

3 討 論

骨折指骨結(jié)構(gòu)的連續(xù)性完全或部分斷裂,是各年齡層人們常見的創(chuàng)傷,尤其在老年患者中更為常見。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、交通運輸工具的增加與社會人口老齡化的加劇,骨折的發(fā)生率同樣在增加,成為需要重點關(guān)注的社會醫(yī)療問題〔7〕。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,骨折的治愈率越來越高。在現(xiàn)有醫(yī)療技術(shù)下骨折患者的治療需求不僅僅局限于恢復(fù)骨折部位愈合強度,同時更希望縮短恢復(fù)周期。骨折的恢復(fù)愈合是一系列過程,其中最關(guān)鍵的便是炎癥期與重塑期〔8,9〕。各階段的不良因素可阻礙骨折愈合進程,從而導(dǎo)致骨折延遲愈合甚至骨不連〔10〕,給患者家庭及社會帶來額外的經(jīng)濟負擔(dān)。

研究表明,當(dāng)骨折部位新生軟骨組織開始發(fā)育后,新生血管床環(huán)繞并長入愈傷組織中,使組織修復(fù)區(qū)域的血流量增加,并促進軟骨細胞的凋亡及軟骨鈣化為新生骨〔11,12〕,因此局部血管生成是骨折部位愈合過程中十分重要的一環(huán)。在一些研究中,VEGF/Akt信號通路參與多種生物學(xué)進程,包括促進血管內(nèi)皮生成、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的增殖分化及影響細胞的凋亡等〔13〕,是一條與血管形成具有緊密聯(lián)系的通路。VEGF是生理和病理生理狀態(tài)下血管生成的重要調(diào)節(jié)因子,在病理性血管形成過程中,VEGF是強大的促血管新生和促血管滲透因子,能結(jié)合血管內(nèi)皮細胞上的特異性受體,對內(nèi)皮細胞發(fā)揮趨化和促分化作用,促進內(nèi)皮細胞增殖和迀移,研究證實VEGF能夠活化Akt〔14〕,而Akt通過增加內(nèi)皮修復(fù)和再生,影響破骨細胞的募集、存活與活力〔15,16〕,從而在血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外,Akt能夠激活內(nèi)皮細胞中的eNOS,增加一氧化氮的產(chǎn)生,保護軟骨內(nèi)皮細胞的凋亡,依次介導(dǎo)了組織損傷和修復(fù),極大地促進了血管生成反應(yīng)〔17〕。因此VEGF/Akt信號通路在骨折大鼠愈合過程中或許發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果表明,過表達VEGF的確能夠增加Akt與eNOS的表達水平,與其他研究結(jié)果一致。此外,過表達VEGF同樣能夠增強成骨標記物BALP的含量,顯著增強骨組織的愈合強度及韌性,加快愈合進程,提示在VEGF/Akt信號通路激活的狀態(tài)下機體成骨功能較強。

現(xiàn)在普遍認為炎癥細胞和骨愈合相關(guān)細胞之間的相互干擾對骨的形成、修復(fù)和重塑至關(guān)重要〔18〕。多項研究表明,在骨折后患者機體炎癥水平顯著上升,如果不能得到及時的干預(yù),則可能由于持續(xù)的活動性炎癥、纖維化或慢性炎癥導(dǎo)致永久性組織改變〔19〕,其后續(xù)治療效果與治療周期均會受到一定的影響。在損傷后炎癥初期,特異性細胞介導(dǎo)的免疫功能開始發(fā)揮作用,具有炎癥和免疫功能的細胞因子如TNF-α等會被大量釋放〔20〕。TNF-α為一種強效促炎的細胞因子,通過影響腎上腺皮質(zhì)功能參與機體炎癥反應(yīng),并能通過提高中性粒細胞的吞噬能力,激活一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo),刺激內(nèi)皮細胞對IL-6及IL-1α的分泌,引起機體炎癥環(huán)境進一步紊亂〔21,22〕。因此,一方面機體會由于炎癥環(huán)境導(dǎo)致?lián)p傷部位的細菌感染率增加,另一方面過多的炎癥因子會引起骨骼中骨髓間充質(zhì)干細胞的分化延遲,影響骨骼的愈合〔23〕。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致。

綜上,VEGF/Akt信號通路在骨折大鼠中通過促進血管生成及降低炎癥因子水平來促進骨折部位的愈合,為骨折愈合的分子機制提供了一定的理論基礎(chǔ),為骨折愈合治療藥物的開發(fā)提供了思路與證據(jù)。本研究的不足之處在于未對其他可能參與骨愈合過程的信號通路進行研究分析,希望在后續(xù)的研究中能探討其可能性。