陳瑜 陶石 胡敏 徐璐 王嬌 符才波 周威倫

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科 海南省臨床醫(yī)學(xué)中心,海南 ?？?570100)

白血病是因造血干細(xì)胞出現(xiàn)特異變化的克隆性惡性疾病〔1,2〕,該病患者伴有貧血、淋巴腫大等癥狀〔3,4〕。今年來(lái),白血病在我國(guó)的發(fā)病率和病死率逐漸攀升,位于世界中等水平〔5,6〕。目前,白血病的治療手段已化療為主,并沒(méi)有明確的特效藥。但化療藥物毒副作用大,所以尋找效果良好且毒副作用小的藥物刻不容緩。有研究表明,許多中藥提取物對(duì)白血病細(xì)胞有殺傷作用,如雷公藤甲素、人參多糖等〔7,8〕,這類中藥提取物還具有對(duì)人體毒副作用小,成本低,治療效果好的優(yōu)點(diǎn)。槲皮素是天然化合物,屬于黃酮類,在花、葉和果子中可以提取,也在部分中藥中可以提取,對(duì)炎癥反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng),病毒、細(xì)菌、癌細(xì)胞等具有較好的治療作用,近些年來(lái),關(guān)于其對(duì)腫瘤的抑制、抵抗作用也被廣泛研究報(bào)道〔9～13〕。本研究旨在體外培養(yǎng)白血病細(xì)胞,探討槲皮素對(duì)白血病細(xì)胞的增殖、凋亡及殺傷效果,同時(shí)對(duì)可能存在的作用機(jī)制進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑、儀器 人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60,貨號(hào):CL-0110,公司:普諾賽);槲皮素(貨號(hào):Q4951,公司:Sigma);二甲基亞砜(DMSO,貨號(hào)0219605580,公司:MP Biomedicals);RPMI1640培養(yǎng)基(貨號(hào)PM150110P,公司:普諾賽);胎牛血清(貨號(hào):164210,公司:普諾賽);CCK-8(貨號(hào)P-CA-001,公司:普諾賽);TUNEL(貨號(hào):P-CA-007,公司:普諾賽);Hoechst33342染色液購(gòu)自北京萌壯科技有限公司;TDL-80-2B低俗臺(tái)式離心機(jī);瑞沃德CO2培養(yǎng)箱:賽默飛的酶標(biāo)儀和蛋白成像系統(tǒng);Leica徠卡熒光顯微鏡;默克光度計(jì)和電泳儀;轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自的山海艾研生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HL-60轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2培養(yǎng),每2～3 d傳代換液,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3槲皮素配制 槲皮素溶解于DMSO配成40 μmol/L儲(chǔ)備液,-20 ℃冰箱保存,以RPMI1640培養(yǎng)液稀釋到10、20、40 μmol/L。

1.4CCK-8法檢測(cè)HL-60增殖活力 調(diào)整HL-60密度2×105個(gè)/ml,接種于96孔板。加入不同濃度的槲皮素100 μl〔14〕(10、20、40 μmol/L),分別記為槲皮素10、20、40 μmol/L組,另加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl為空白組。分別等待24、48、72 h,加入10 μl CCK-8,靜置3 h。計(jì)算增殖率。不同濃度設(shè)6個(gè)對(duì)照,取平均值,下同。

1.5TUNEL法檢測(cè)HL-60凋亡情況 藍(lán)色熒光為細(xì)胞核未凋亡,綠色熒光為細(xì)胞核凋亡或破碎。熒光顯微鏡下選10個(gè)視野進(jìn)行鏡下觀察,計(jì)算凋亡率。凋亡率 =(視野內(nèi)凋亡HL-60細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)HL-60總數(shù))×100%。

1.6細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HL-60黏附力 細(xì)胞分組、處理、加藥同上。在24孔板接種。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,0.1%結(jié)晶紫染色,0.2% Triton X-100固定,紫外分光光度計(jì)在550 nm處檢測(cè)各孔 A,計(jì)算黏附率。黏附率= A給藥組/A空白組×100%。

1.7劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HL-60遷移能力 調(diào)整HL-60密度2×105個(gè)/ml,接種于96孔板。細(xì)胞單層生長(zhǎng)鋪滿時(shí),無(wú)菌移液槍頭均勻劃線,PBS沖洗劃落細(xì)胞。37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)48 h,測(cè)量劃痕處細(xì)胞遷移面積,計(jì)算遷移率。遷移率=給藥組遷移面積/空白組遷移面積×100%。

1.8transwell法檢測(cè)HL-60侵襲能力 基質(zhì)膠4 ℃靜置一夜,直至融化,培養(yǎng)基稀釋(1∶3),取40 μl均勻鋪于下室,37 ℃孵育1 h,待其膠凝,待用。37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)48 h,分別取200 μl接種于transwell小室上室,并在transwell小室下室加入含有20%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液600 μl。 37 ℃、5% CO2及飽和濕度等待24 h后,去掉未穿膜細(xì)胞,收集遷移至濾膜下層的細(xì)胞,甲醇固定,染色。計(jì)算侵襲數(shù)。

1.9Western印跡檢測(cè) caspase8、9、3 蛋白表達(dá) 調(diào)整HL-60密度2×105個(gè)/ml,接種于96孔板,加入40 μmol/L槲皮素分別培養(yǎng)24與48 h,記為槲皮素40 μmol/L 24、48 h組,另加入RPMI1640培養(yǎng)液100 μl為空白組。提取總蛋白,測(cè)定濃度。配制聚丙烯酰胺凝,添加電泳液。濃縮:采用100 V恒壓電泳約20 min;分離:采用恒壓120 V電泳約60 min。轉(zhuǎn)膜25 min,封閉液封閉2 h,分別加3 μl的caspase8、9、3一抗4 ℃過(guò)夜,洗脫一抗20 min,每10 min一次換液,然后用1.5 μl 二抗37 ℃搖床孵育1 h,洗脫二抗1 h,顯影,掃膜儀成像。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t或F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TUNEL法檢測(cè)HL-60凋亡情況 與空白組相比,槲皮素各組HL-60凋亡指數(shù)顯著增加,且隨槲皮素濃度增加呈顯著劑量依賴性(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

表1 HL-60增殖活力、凋亡情況、黏附力、遷移能力、侵襲能力比較

圖1 各組HL-60凋亡、遷移、侵襲

2.2劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HL-60遷移能力 與空白組相比,槲皮素組HL-60遷移率顯著降低,隨槲皮素濃度增加,遷移率呈顯著劑量依賴性(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

2.3transwell法檢測(cè)HL-60侵襲能力 與空白組相比,槲皮素組HL-60侵襲數(shù)降低,且槲皮素濃度越高,細(xì)胞侵襲數(shù)越少,見(jiàn)圖1、表1。

2.4CCK-8法檢測(cè)HL-60增殖活力 與空白組相比,槲皮素各濃度組細(xì)胞增殖抑制率顯著增加(P<0.05),且抑制率隨時(shí)間和濃度的增加而顯著加強(qiáng)(P<0.05)。72 h抑制率雖高但過(guò)度抑制,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均以48 h為作用時(shí)間,見(jiàn)表1。

2.5細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HL-60黏附力 與空白組相比,槲皮素各組HL-60黏附率顯著降低,且隨槲皮素濃度增加,黏附率呈顯著劑量依賴性降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.6Western印跡檢測(cè)caspase8、9、3蛋白表達(dá) 槲皮素40 μmol/L 24 h組、槲皮素40 μmol/L 48 h組caspase9、3蛋白的表達(dá)量較空白組顯著升高(P<0.05)。槲皮素40 μmol/L 48 h組caspase9、3表達(dá)量比槲皮素40 μmol/L 24 h組顯著增高(P<0.05)。3組caspase8差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組caspase8、9、3蛋白表達(dá)比較

1～3:空白組、槲皮素40 μmol/L 24、48 h組圖2 各組caspase8、9、3蛋白表達(dá)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)表明,槲皮素對(duì)白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用,可將其投入臨床,應(yīng)用于白血病患者的醫(yī)治。白血病的發(fā)生發(fā)展與惡性克隆的造血功能細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān),這個(gè)特點(diǎn)使的絕大多數(shù)白血病患者難以治愈〔15〕。所以,降低白血病細(xì)胞的遷移和侵襲是治療的一個(gè)思路,但白血病細(xì)胞的遷移和侵襲非常復(fù)雜〔16〕。白血病是非實(shí)體瘤,所以白血病細(xì)胞的遷移和侵襲與常規(guī)的實(shí)體瘤略有不同,但大致過(guò)程例如細(xì)胞黏著、基質(zhì)合成與降解等是相似的。本研究表明,槲皮素能夠抑制白血病細(xì)胞的黏附率、遷移率和侵襲率,并且隨著槲皮素濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),這意味著槲皮素可以抑制白血病細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

caspase與細(xì)胞的凋亡密切相關(guān),它是一種蛋白激酶,具有相似的氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和特異性〔17〕。caspase活化后會(huì)引起細(xì)胞凋亡,這與其對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)酶解、滅活阻止細(xì)胞凋亡有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)相關(guān)〔18〕。caspase8、9是調(diào)控caspase,與打靶和激活調(diào)控相關(guān),其中caspase8還能夠傳遞凋亡信號(hào);caspase3是效應(yīng)caspase,是參與凋亡的效應(yīng)物〔19,20〕。本研究表明,槲皮素作用后caspase9、3蛋白的表達(dá)量顯著變化,出現(xiàn)上調(diào),并且隨槲皮素作用時(shí)間增加,上調(diào)越明顯,所以由此猜測(cè),槲皮素誘導(dǎo)的是內(nèi)源性通路介導(dǎo)的凋亡。

綜上,槲皮素能夠抑制白血病細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并且對(duì)白血病具有較強(qiáng)的殺傷作用,這與內(nèi)源性通路中caspase9和3蛋白介導(dǎo)的凋亡密切相關(guān),本文為槲皮素在臨床上應(yīng)用于白血病的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),其具體的通路機(jī)制還需進(jìn)一步研究。