程耿 周艦 楊軍 張朝陽 萬莉

(武漢市第三醫(yī)院暨武漢大學(xué)同仁醫(yī)院 1泌尿外科,湖北 武漢 430000;2皮膚科)

前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,具有易遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和侵襲的特性,不僅累及患者膀胱和精囊,還會侵襲骨組織,導(dǎo)致血尿、血精、骨痛、骨折等癥狀,是造成男性死亡的主要癌癥類型〔1,2〕。很多研究證實長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因(LncRNA SNHG)3具有致癌作用,在胃癌、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤中過表達(dá),參與其病情進(jìn)展,與腫瘤臨床分期和患者生存率降低密切相關(guān),下調(diào)SNHG3表達(dá)可降低胃癌和卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移活性〔3,4〕,并抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,延緩其腫瘤生長和骨轉(zhuǎn)移〔5〕。miR-330-5p是具有抑癌活性的微小RNA分子,在大腸癌、前列腺癌中表達(dá)降低,促使miR-330-5p分泌可抑制大腸癌細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡〔6〕,過表達(dá)miR-330-5p可通過抑制癌細(xì)胞增殖、凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化而延緩前列腺癌進(jìn)展〔7〕。P21活化激酶(PAK)1是miR-330-5p的下游靶基因,miR-330-5p可直接靶向下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中PAK1上調(diào),從而抑制其增殖、侵襲和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程〔8〕。另外PAK1在前列腺癌中表達(dá)明顯升高,下調(diào)PAK1可抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移〔9,10〕。因此mir-330-5p/PAK1可作為前列腺癌的重要治療靶點。有研究顯示,在乳腺癌細(xì)胞中LncRNA SNHG3可靶向下調(diào)miR-330-5p,從而介導(dǎo)促進(jìn)其增殖〔11〕,本研究探討LncRNA SNHG3通過miR-330-5p/PAK1信號軸調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 人前列腺上皮細(xì)胞(貨號CP-H019)、人前列腺上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基(貨號CM-H019)、PC-3細(xì)胞(貨號CL-0185)、Ham F-12K培養(yǎng)基(貨號PM150910)、VCaP細(xì)胞(貨號CL-0241)、DMEM培養(yǎng)基(貨號PM150210)、DU 145細(xì)胞(貨號CL-0075)、MDM培養(yǎng)基(貨號PM150410)、胎牛血清(貨號164210-500)、青鏈霉素混合液(貨號PB180120)購自武漢普諾賽生命科技有限公司;PAK1、miR-330-5p、U6與GAPDH引物、LncRNA SNHG3 siRNA、miR-330-5p inhibitor、LncRNA SNHG3 siRNA陰性對照、miR-330-5p inhibitor陰性對照、野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒、LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒、LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒、突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-330-5p 3′-UTR無義序列均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(貨號M1020)、脂質(zhì)體2000(貨號L7800)、膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號CA1020)、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒(貨號CA1170)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(貨號31985070)、一步法實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(貨號T2210)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號D0010)購自北京索萊寶科技有限公司等。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012)、伊紅染色液(貨號C0109)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號A0208)、RIPA裂解液(貨號P0013E)均購自上海碧云天公司。兔源抗大鼠抗-GAPDH抗體(貨號ab181602)、兔源抗大鼠抗-Vimentin抗體(貨號ab193555)、兔源抗大鼠抗-E-cadherin抗體(貨號ab76319)購自美國Abcam公司等。酶標(biāo)儀-型號iMark,RT-PCR儀-型號CFX96,基礎(chǔ)電泳儀電源-型號1645050,蛋白電泳儀與轉(zhuǎn)膜儀(型號Mini PROTEAN)均購自BIO-RAD公司(美國);熒光顯微鏡(型號FSX100)購自日本奧林巴斯公司;雙目顯微鏡(型號DM3000)購自Leica公司(德國);智能熒光流式細(xì)胞儀(型號Countstar Rigel),Countstar Rigel智能熒光流式細(xì)胞儀(中國)等。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及各細(xì)胞系中LncRNA SNHG3、miR-330-5p與PAK1表達(dá)檢測 于39.5 ℃水浴中快速解凍購買的人前列腺上皮細(xì)胞及人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、DU 145、VCaP,以含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的培養(yǎng)基復(fù)蘇培養(yǎng),細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時進(jìn)行傳代,將傳代的各種細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng),細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿時收集細(xì)胞沉淀,使用總RNA提取試劑盒自各種細(xì)胞中提取純化總RNA后,采用一步法qRT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴增,實驗步驟均遵照各自試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行,得到的各細(xì)胞樣品循環(huán)閾值通過2-ΔΔCt法做分析,以內(nèi)參基因GAPDH作標(biāo)準(zhǔn),計算出各基因相對表達(dá)水平,其引物序列(5′-3′),PAK1正向:CGCCCAGAGCACACAAAATC,反向:GTCCCGAGTTGGAGTGACAG;miR-330-5p正向:TCTCTGGGCCTGTGTCTTAG,反向:CAGTGCGTGTCGTGGAGT;GAPDH正向:CAGGAGGCATTGCTGATGAT,反向:GAAGGCTGGGGCTCATTT;U6正向:TCCGATCGTGAAGCGTTC,反向:GTGCAGGGTCCGAGGT;E-cadherin正向:TACAACGACCCAACCCAA,反向:TCCTCCGAAGAAACAGCA;Vimentin正向:GCGTGACGTACGTCAGCAATATGA,反向:GTTCCAGGGACTCATTGGTTCCTT。

1.3分組轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞及收集標(biāo)本 將傳代的PC-3細(xì)胞接種在12孔板,無菌培養(yǎng)12 h后隨即分為對照組、LncRNA SNHG3 siRNA組、miR-330-5p inhibitor組、共轉(zhuǎn)染陰性對照(LncRNA SNHG3 siRNA陰性對照+miR-330-5p inhibitor陰性對照)組、共轉(zhuǎn)染(LncRNA SNHG3 siRNA+miR-330-5p inhibitor)組,以脂質(zhì)體分組轉(zhuǎn)染LncRNA SNHG3 siRNA及其陰性對照、miR-330-5p inhibitor及其陰性對照,具體步驟遵照脂質(zhì)體說明書指導(dǎo)進(jìn)行,繼續(xù)無菌培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞沉淀。

1.4PC-3細(xì)胞增殖及凋亡檢測 取96孔板,將各孔隨即分為空白對照組、對照組、LncRNA SNHG3 siRNA組、miR-330-5p inhibitor組、共轉(zhuǎn)染陰性對照組、共轉(zhuǎn)染組,每組6個孔,空白對照組不接種細(xì)胞,其余各組接種傳代的PC-3細(xì)胞,無菌培養(yǎng)12 h后按照1.3中方法分組轉(zhuǎn)染24 h后,加入MTT液50 μl培養(yǎng)4 h,然后小心吸出上清,每孔加入二甲基亞砜150 μl,置于酶標(biāo)儀中震蕩,充分溶解結(jié)晶物后測定490 nm下各孔吸光值,計算細(xì)胞活力(%)=(轉(zhuǎn)染組吸光值-空白對照組吸光值)/(對照組吸光值-空白對照組吸光值)×100%;將傳代的PC-3細(xì)胞接種在24孔板,無菌培養(yǎng)12 h后按照1.3中方法分組并轉(zhuǎn)染,24 h后以50 μmol/L EdU孵育2 h,小心吸出培養(yǎng)基后洗滌細(xì)胞,4%多聚甲醛固定后,參照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書指導(dǎo)于熒光顯微鏡下觀察檢測細(xì)胞增殖情況,以對照組EdU陽性細(xì)胞數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)計算各組EdU陽性細(xì)胞相對于對照組的比值,作為各組細(xì)胞相對增殖率,將對照組相對增殖率記為100%。

以磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸1.3中收集的各組細(xì)胞,于37.5 ℃下分別避光孵育10 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,15 min后離心洗滌細(xì)胞沉淀,再次以500 μl PBS重懸各組細(xì)胞后上樣,采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況,所得數(shù)據(jù)運用Muticycle AV軟件進(jìn)行分析,即能獲得各組細(xì)胞凋亡率。

1.5PC-3細(xì)胞侵襲情況檢測 以含血清的培養(yǎng)基重懸1.3中收集的各組細(xì)胞,以細(xì)胞計數(shù)板測出各組細(xì)胞濃度后,均調(diào)整為5×105個/ml,每組取250 μl細(xì)胞懸液分別接種在基質(zhì)膠包被過的Transwell上室中,在Transwell下室中同時加入無血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后擦去上室細(xì)胞,以PBS洗滌下室細(xì)胞后,固定、伊紅染色液孵育,于光學(xué)顯微鏡下觀察并計數(shù)著色細(xì)胞,隨機選6個視野拍照。

1.6PC-3細(xì)胞miR-330-5p、PAK1與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子E-鈣黏附蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)檢測 以qRT-PCR實驗檢測PC-3細(xì)胞miR-330-5p、PAK1、E-cadherin與Vimentin mRNA表達(dá),具體步驟參照1.2中方法進(jìn)行。

1.7檢測PC-3細(xì)胞中LncRNA SNHG3對miR-330-5p的靶向調(diào)控 將傳代的PC-3細(xì)胞接種在12孔板,無菌培養(yǎng)12 h后隨機分為轉(zhuǎn)染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒組,以1.3中方法分組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及RNA序列,24 h后收集各組細(xì)胞沉淀檢測其雙熒光素酶相對活性,具體步驟參照采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1前列腺癌細(xì)胞中LncRNA SNHG3、miR-330-5p與PAK1 mRNA的表達(dá) 與人前列腺上皮細(xì)胞相比,PC-3、DU 145、VCaP細(xì)胞中LncRNA SNHG3、PAK1 mRNA表達(dá)明顯升高,miR-330-5p mRA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞LncRNA SNHG3、miR-330-5p與PAK1 mRNA相對表達(dá)水平

2.2LncRNA SNHG3對PC-3細(xì)胞增殖的影響 與對照組、共轉(zhuǎn)染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細(xì)胞活力與相對增殖率均明顯降低,miR-330-5p inhibitor組細(xì)胞活力與相對增殖率均明顯升高(P<0.05),共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞活力與相對增殖率均無顯著差異(P>0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組PC-3細(xì)胞增殖(Edu染色,×200)

表2 各組細(xì)胞活力與相對增殖率

2.3LncRNA SNHG3對PC-3細(xì)胞凋亡的影響 與對照組、共轉(zhuǎn)染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05),miR-330-5p inhibitor組細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P<0.05),共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞凋亡率均無顯著差異(P>0.05)。見圖2、表3。

圖2 流式細(xì)胞實驗檢測各組PC-3細(xì)胞凋亡

表3 各組細(xì)胞凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞Vimentin、E-cadherin、miR-330-5p、PAK1 mRNA相對表達(dá)水平

2.4LncRNA SNHG3對PC-3細(xì)胞miR-330-5p與PAK1 mRNA表達(dá)的影響 與對照組、共轉(zhuǎn)染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細(xì)胞miR-330-5p mRNA表達(dá)水平均明顯升高,PAK1 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05);miR-330-5p inhibitor組細(xì)胞miR-330-5p mRNA表達(dá)水平均明顯降低,PAK1 mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05);共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞miR-330-5p與PAK1 mRNA表達(dá)水平均無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.5LncRNA SNHG3對PC-3細(xì)胞侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 與對照組、共轉(zhuǎn)染組相比,LncRNA SNHG3 siRNA組細(xì)胞Vimentin mRNA表達(dá)、侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯降低,E-cadherin mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05);miR-330-5p inhibitor組細(xì)胞Vimentin mRNA表達(dá)、侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯升高,E-cadherin mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05);共轉(zhuǎn)染陰性對照組細(xì)胞Vimentin和E-cadherin mRNA表達(dá)、侵襲細(xì)胞數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。見表3、圖3。

圖3 Transwell遷移實驗檢測各組PC-3細(xì)胞侵襲(伊紅染色,×200)

2.6LncRNA SNHG3對PC-3細(xì)胞miR-330-5p的靶向調(diào)節(jié) 運用TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)測LncRNA SNHG3與miR-330-5p之間的結(jié)合位點,見圖4。與轉(zhuǎn)染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒組(1.01±0.17)比較,轉(zhuǎn)染野生型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒組相對熒光素酶活性(0.41±0.03)顯著降低(t=8.514,P=0.000);與轉(zhuǎn)染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒組(1.04±0.22)比較,轉(zhuǎn)染突變型miR-330-5p 3′-UTR報告質(zhì)粒+LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒組相對熒光素酶活性(1.02±0.24)無明顯差異(t=0.150,P=0.883);與轉(zhuǎn)染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3空載質(zhì)粒組(0.98±0.19)比較,轉(zhuǎn)染miR-330-5p 3′-UTR無義序列+LncRNA SNHG3過表達(dá)質(zhì)粒組相對熒光素酶活性(0.97±0.25)無明顯差異(t=0.078,P=0.939)。

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫預(yù)測到LncRNA SNHG3與miR-330-5p之間存在結(jié)合位點

3 討 論

目前臨床中前列腺癌患者的預(yù)后及生存率并不理想,對前列腺癌發(fā)病機制進(jìn)行深入探究,尋找更有特異性的分子治療靶點,是腫瘤臨床研究的重要課題〔12,13〕。SNHG3作為癌基因,在肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮明顯的致癌作用,過表達(dá)SNHG3可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,敲除SNHG3基因可抑制乳腺癌細(xì)胞異種移植腫瘤生長〔14〕。此外,SNHG3在前列腺癌中異常高表達(dá),抑制SNHG3可降低前列腺癌細(xì)胞增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化活性,進(jìn)而減弱其侵襲遷移,延緩前列腺癌病情進(jìn)展〔15〕。本實驗結(jié)果表明,LncRNA SNHG3參與調(diào)控前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為,敲低SNHG3基因可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,降低其增殖及侵襲活性,并促進(jìn)其凋亡發(fā)生,與以前的研究相似,進(jìn)一步證實了SNHG3是前列腺癌治療靶點。

miR-330-5p是調(diào)控肺癌、大腸癌、前列腺癌等多種類型腫瘤的微小RNA,在腫瘤中發(fā)揮抑癌作用,促進(jìn)miR-330-5p表達(dá)可抑制肺癌增殖、糖酵解,并在體內(nèi)抑制其異種移植腫瘤生長〔16〕,還可減弱前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖和侵襲遷移〔17〕;其下游靶基因PAK1具有明顯致癌作用〔8〕,在前列腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)較高水平,PAK-1抑制劑可降低前列腺癌細(xì)胞活力,并抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程〔18,19〕,表明miR-330-5p/PAK1是前列腺癌的候選分子治療靶點。本實驗結(jié)果表明,miR-330-5p/PAK1參與介導(dǎo)敲低SNHG3對PC-3細(xì)胞增殖及侵襲的抑制過程,LncRNA SNHG3可通過miR-330-5p/PAK1信號軸調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上,LncRNA SNHG3可通過靶向調(diào)節(jié)miR-330-5p介導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等生物學(xué)行為,下調(diào)SNHG3基因可通過促使miR-330-5p分泌,抑制PAK1基因表達(dá),從而降低前列腺癌細(xì)胞活力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化活性,誘導(dǎo)其大量凋亡,并抑制其增殖及侵襲。