梁燕 武海博 張肖 孫軍 傅國惠 張保朝 周國平

(南陽市中心醫(yī)院,河南 南陽 473000)

抑郁癥是臨床發(fā)病率較高的精神疾病之一,患者通常伴有免疫系統(tǒng)激活,免疫激活產生的細胞因子可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的多個方面,進而引發(fā)一系列抑郁癥狀〔1〕。近年來,抑郁癥的患病人數(shù)逐漸增多,甚至青少年抑郁癥的發(fā)病率呈顯著增長趨勢,青少年患有抑郁癥后可遷延至成年、疾病負擔重、癥狀不典型等特點,嚴重影響其社會功能〔2,3〕。抑郁癥患者的常見臨床表現(xiàn)為意志減弱甚至衰退,悲觀厭世,甚至出現(xiàn)自殺等〔4〕。針灸是我國中醫(yī)的主要治療方法之一,該種治療方法是利用針刺手段對人體穴位產生一定的刺激,進而作用于病灶處,來達到治療的效果,還可利用在人體體表的熱刺激來達到治療或保健的作用〔5〕?，F(xiàn)今,隨著醫(yī)療行業(yè)的不斷發(fā)展,中醫(yī)針灸中的針法逐漸延伸出電針等新穎針法,其中,電針是依靠電頻率的刺激,使針灸的刺激頻度增加,從而提升治療效果〔6〕。柴胡疏肝散是臨床中常用中藥之一,該方具有疏肝理氣、活血止痛的功效,近年來,柴胡疏肝散在臨床中醫(yī)中的應用率逐漸升高,該方可用于多種疾病的治療〔7〕。抑郁癥患者多采用藥物治療,其中西藥居多,但西藥會對患者身體產生較大副作用,因此,本文采用柴胡疏肝散聯(lián)合電針對抑郁大鼠進行治療,觀察中藥與針灸對大鼠的治療作用及具體機制。

1 材料與方法

1.1一般材料 在廣東省醫(yī)學SD大鼠中心購買15只雄性SD大鼠,體質量187～240 g,3～4周齡。

1.2模型制備與分組 將所選取的大鼠根據(jù)是否造模及給予不同藥物分為:抑郁組:制作抑郁大鼠模型;健康組:正常培養(yǎng),不做任何處理;電針組:制作抑郁模型后給予電針進行治療;柴胡疏肝散組:制作抑郁模型后給予柴胡疏肝散進行治療;聯(lián)合組:制作抑郁模型后給予電針聯(lián)合柴胡疏肝散進行治療;每組3只。造模動物全部接受孤養(yǎng)。大鼠共接受21 d各種不同刺激,包括:強迫游泳10 min(水溫0 ℃)、夾尾3 min、熱應激(45 ℃,5 min)、白噪聲刺激(90 dB)6 h、束縛 3 h,每天隨機選擇1種方法進行刺激。健康組大鼠不接受上述任何刺激。從造模3 w起,給予電針組大鼠電針治療,參照《常用動物腧穴圖譜》針刺穴位,刺激參數(shù):疏密波,頻率2 Hz/10 Hz,電流強度1 mA,持續(xù)30 min;給予柴胡疏肝散組每日灌胃一次,柴胡疏肝散劑量為1 ml/100 g體質量;聯(lián)合組在電針組基礎上加用柴胡疏肝散;健康組、抑郁組正常飼養(yǎng),持續(xù)治療8 w。在此期間,所有大鼠在相同環(huán)境下生活。實驗完成后,對大鼠行水迷宮行為測試,測試完成后,將大鼠分別處死并選取海馬組織,檢測活性程度。

1.3儀器與試劑 Guava流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特,型號:CytoFLEX);柴胡疏肝散(川芎9 g、柴胡12 g、白芍12 g、香附9 g、枳殼9 g、陳皮9 g、炙甘草6 g;山東牧匠生物公司,生產批號:Z20054628 );凝膠電泳儀(濟南歐萊博電子商務有限公司,型號:Mini Trans-Blot);Transwell 小室(北京優(yōu)尼康生物公司);鈣調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ一抗(北京百奧萊博科技有限公司);單胺氧化酶(MAO)試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司,生產批號:S20030042);磷酸鹽緩沖液(PBS,上海康朗生物科技有限公司,產品編號:LM1050);細胞外基質(ECM)膠(奧泰利新技術公司,生產批號:20190702)。

1.4水迷宮行為測試 將大鼠放在起點開始水迷宮訓練,適應后,將5個盲端全部開放,記錄大鼠從水迷宮起點到達終點安全臺所需時間作為潛伏期,同時記錄每只大鼠中途進入盲端的錯誤次數(shù)。每天上午訓練,每天每只大鼠重復訓練3次。

1.5流式細胞法 取海馬組織提取神經(jīng)元細胞,將其密度調整為1.2×106/L,常規(guī)培養(yǎng),0.01 mol/L PBS洗滌,1 600 r/min離心5 min,-4 ℃保存,PBS洗滌3次,水浴,吹打均勻,4 ℃避光孵育30 min。使用Guava流式細胞儀進行流式上樣檢測,并檢測其細胞凋亡率。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 常規(guī)采集各組大鼠靜脈血,采用ELISA檢測MAO的表達水平。

1.7實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測CaMKⅡ mRNA的表達量 按200 μl三氯甲烷/ml三甘醇加入三氯甲烷配制三氯甲烷/三甘醇試劑,加入6孔板中振蕩混勻,室溫放置15 min,隨后轉入EP管中,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,吸取上清水相至另一離心管內,加入吸上清量的0.7～1.0倍體積的異丙醇,室溫放置10～30 min,12 000 r/min離心10 min,棄上清,RNA沉于管底,按1 ml 75%乙醇/ml三甘醇加入75%乙醇,溫和振蕩離心管,懸浮沉淀,4 ℃12 000 r/min離心5 min,盡量棄上清超凈臺吹干10～20 min,加10～50 μl焦炭酸二乙酯(DEPC)處理過的ddH2O溶沉淀,使用oneDrop微量分光光度儀測定濃度。按照無酶無菌水(RNase free dH2O)4.5 μl、5×逆轉錄反應緩沖液 2 μl、隨機引物0.5 μl、寡聚脫氧胸苷酸(Oligo dT)0.5 μl、反轉錄酶0.5 μl、RNA 2 μl進行反轉錄反應。將cDNA樣品分成3份,每組總cDNA樣本稀釋20倍,取3 μl的cDNA進行PCR擴增反應。使用5%瓊脂糖凝膠電泳驗證靶基因的擴增水平。使用LabWorks4.0圖像采集和分析軟件進行定量和數(shù)據(jù)處理。為獲得可靠的數(shù)據(jù),每組樣本重復3次。應用2-ΔΔCt法分析、目標基因的相對表達含量變化。引物序列:CaMKⅡ正義鏈:5′-TGACAGCCATCATCAAAGAGA-3′,反義鏈:5′-CAGGAAATCCCATAGCAATAAT-3′;GAPDH正義鏈5′-TGAACGGGAAGC-TCACTGG-3′,反義鏈:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.8Western印跡法 配制細胞裂解液,取適量RIPA,并加入蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)混勻,RIPA∶PMSF的比例為100∶1。0.25%胰酶消化細胞,離心棄上清,加入細胞裂解液,在低溫高速離心機下4 ℃、14 000 r/min離心30 min,吸取蛋白上清液。隨后95 ℃熱浴10 min,對蛋白進行變性。將制備好的蛋白樣品置于-80 ℃冰箱備用。使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對蛋白進行定量。定量后,配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將蛋白樣品上樣到 SDS-PAGE加樣孔內,進行電泳,電泳條件為恒壓(80 V)電泳2.5 h。隨后使用半干轉的方法,應用聚偏氟乙烯(PVDF)膜進行轉膜。轉膜完畢后,將PVDF膜浸入含有5%脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(TBS)+聚山梨醇酯-20(TBST)緩沖液,緩慢搖床1 h,進行封閉。封閉完畢后,用5%脫脂奶粉稀釋抗體,孵育一抗。一抗孵育完畢后,使用TBST溶液漂洗3次,每次10 min。室溫下孵育二抗2 h,二抗孵育完畢后,使用TBST漂洗2遍,TBS漂洗1遍,每次10 min。使用電化學發(fā)光(ECL)試劑來檢測蛋白,在暗室進行曝光。使用Image-Pro Plus6(Media Cybernetics,Silver Spring,MD)軟件分析蛋白的相對表達量。GAPDH 作內參,檢測蛋白表達。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1水迷宮行為檢測大鼠空間學習記憶能力 健康組潛伏期時間最長,錯誤次數(shù)最少;抑郁組潛伏期時間最短,錯誤次數(shù)最多;與抑郁組相比較,電針組、柴胡疏肝散組、聯(lián)合組空間學習記憶能力顯著更優(yōu)(均P<0.05),其中,聯(lián)合組空間學習記憶能力顯著優(yōu)于電針組、柴胡疏肝散組(均P<0.05)。見表1。

表1 各組空間學習記憶能力、凋亡率、MAO表達、CaMKⅡ mRNA及蛋白表達比較

2.2海馬神經(jīng)元細胞的凋亡情況 抑郁組、電針組、柴胡疏肝散散、聯(lián)合組海馬神經(jīng)元細胞凋亡率顯著高于健康組(均P<0.05),電針組、柴胡疏肝散組、聯(lián)合組海馬神經(jīng)元細胞的細胞凋亡率顯著低于抑郁組(均P<0.05),與聯(lián)合組比較,電針組、柴胡疏肝散組細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。 見表1、圖1。

圖1 各組海馬神經(jīng)元細胞凋亡

2.3ELISA檢測海馬細胞中MAO表達水平 抑郁組、電針組、柴胡疏肝散散、聯(lián)合組細胞中MAO表達水平顯著高于健康組(均P<0.05)。電針組、柴胡疏肝散組、聯(lián)合組海馬神經(jīng)元細胞MAO表達水平顯著低于抑郁組(均P<0.05)。與聯(lián)合組相比,電針組、柴胡疏肝散組細胞MAO表達水平顯著升高(均P<0.05),但電針組、柴胡疏肝散組細胞MAO表達水平無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.4海馬神經(jīng)元細胞中CaMKⅡ mRNA及蛋白表達 抑郁組、電針組、柴胡疏肝散散、聯(lián)合組海馬神經(jīng)元細胞中CaMKⅡ mRNA及蛋白表達量顯著低于健康組(均P<0.05),電針組、柴胡疏肝散組、聯(lián)合組海馬神經(jīng)元細胞CaMKⅡ mRNA及蛋白表達量顯著高于抑郁組(均P<0.05)。與聯(lián)合組相比,電針組、柴胡疏肝散組細胞中CaMKⅡ mRNA及蛋白表達量顯著降低(均P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 Western印跡檢測各組細胞中CaMKⅡ蛋白表達

3 討 論

抑郁癥又被稱為抑郁障礙,是心境障礙的一種重要表現(xiàn),該病已公認為是一種心理神經(jīng)免疫紊亂性疾病〔8〕。抑郁癥發(fā)病原因主要是由于遺傳或神經(jīng)系統(tǒng)上受到一定的損傷,另外也與患者自身性格、心理素質還有社會環(huán)境有密切關系〔9〕。研究顯示,抑郁癥發(fā)生也與季節(jié)存在一定相關性,通常來講,該病在春夏交接季節(jié)的發(fā)病率更高。抑郁癥對患者自身及正常生活、工作的影響較大,因此,對該病的正確認識、積極治療是改善這一患病群體的有效方法,目前,臨床常見的抗抑郁藥均存在起效慢、治療效率低和安全性方面的問題〔10〕。柴胡疏肝散具有疏肝解郁、行氣止痛功效,組成主要包括柴胡、香附、川芎等多種中草藥,能夠對抑郁癥患者有一定的臨床療效。其中,陳皮理氣健脾、燥濕化痰;白芍歸肝脾經(jīng),能平肝止痛,養(yǎng)血調經(jīng),舒筋通絡;枳殼理氣寬中;川芎具有改善血液循環(huán)的功效;柴胡疏肝解郁;炙甘草具有調和諸藥功效;諸藥合用,共奏散除寒濕、通絡止痛之功〔11,12〕。柴胡疏肝散是疏肝解郁的代表方,其確切的抗抑郁作用已被臨床與實驗研究所驗證。研究發(fā)現(xiàn),柴胡疏肝散對慢性應激造成的大鼠體質量與攝食量減少有明顯的上調作用,提示柴胡疏肝散的疏肝健脾功效對抑郁模型大鼠的情緒與食欲均有較好的調節(jié)作用〔13〕。臨床試驗研究顯示,柴胡疏肝散能夠明顯降低抑郁患者的抑郁情緒,柴胡疏肝散在治療過程中具有藥效持續(xù)時間長、不良反應發(fā)生風險較小等顯著優(yōu)勢〔14〕。劉繼剛等〔15〕研究結果顯示,柴胡疏肝散能夠顯著改善抑郁大鼠海馬組織中微管相關蛋白(MAP)-2的表達水平,同時,提升大鼠的糖水偏好百分比,降低實驗過程中大鼠開臂次數(shù)與停留時間,對大鼠整體抑郁情況有較好治療效果。

針灸作為中國的傳統(tǒng)醫(yī)學方法,具有無毒、無副作用等特點,在腦功能保護方面更具獨特的效果。研究發(fā)現(xiàn),電針百會、大椎等穴位可提高大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸蛋白的表達,改善突觸的超微結構,從而有效改善大鼠的學習記憶能力。研究表明,在柴胡疏肝散治療基礎上,采用電針對抑郁大鼠實施治療,可更有效緩解其抑郁程度,改善其海馬神經(jīng)組織的活性,提高治療效果。其主要原因在于柴胡疏肝散與電針均能對抑郁大鼠腦部神經(jīng)予以調節(jié),因此,臨床療效改善效果更為顯著〔16〕。尹平等〔17〕研究表明,電針治療后的抑郁大鼠,其糖水量、強迫游泳時間等行為學癥狀有顯著變化,表明電針對抑郁癥大鼠優(yōu)較佳的治療作用,產生這一現(xiàn)象的作用可能是電針通過影響抑郁大鼠海馬組織中β-CaMKⅡ的表達水平實現(xiàn)的。鈣調蛋白(CaM)信號通路是抑郁癥及抗抑郁治療機制中重要的途徑,可介導多種學習記憶障礙和情緒異?！?8〕。田旭升等〔19〕研究顯示,酸棗仁湯可以顯著改善抑郁模型大鼠的行為活動;上調大鼠抑郁模型海馬CaMKⅡ基因表達,減少神經(jīng)元細胞凋亡,具有抗抑郁作用。

綜上所述,電針與柴胡疏肝散對抑郁大鼠均有改善作用,但兩者聯(lián)合治療的效果更佳,能夠顯著降低海馬神經(jīng)元細胞凋亡率,提高抑郁大鼠空間學習記憶能力,同時,還能夠使大鼠體內MAO水平顯著下降,電針與柴胡疏肝散對抑郁大鼠的作用機制可能與提高CaMK信號蛋白水平有關。