馬英橋 李建梅 孫靜宜

(秦皇島市第四醫(yī)院,河北 秦皇島 066000)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤,嚴重危害女性的生命健康。腫瘤干細胞具有自我更新、無限增殖和多向分化的能力,其可通過轉(zhuǎn)移而形成新的腫瘤,被認為是腫瘤發(fā)生、進展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源〔1〕。盡管現(xiàn)有臨床治療手段多樣,但乳腺癌的整體預(yù)后并不理想,研究發(fā)現(xiàn),50%左右的乳腺癌患者會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,因此,深入研究乳腺癌干細胞侵襲、遷移分子機制,尋找合適治療靶點至關(guān)重要〔2〕。微小 RNA(miR)是非編碼RNA的一種,其可通過與靶基因3′-非翻譯區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后對基因表達起調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)〔3,4〕,miR 參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等過程,乳腺癌也不例外。miR-328是重要的腫瘤調(diào)節(jié)因子,可抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移,并誘導(dǎo)細胞凋亡〔5〕。研究發(fā)現(xiàn),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其可使癌細胞侵襲周圍組織,并逃逸至血管,從而建立遠處轉(zhuǎn)移灶,因此如何改善乳腺癌細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化是目前臨床工作的重點之一。多潛能基因腫瘤干性相關(guān)蛋白(Nanog)是維持胚胎干細胞自我更新、增殖的轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn),其在多種癌癥中異常表達,且Nanog表達水平高的乳腺癌患者預(yù)后差,可作為三陰性乳腺癌患者的預(yù)后因素,Nanog等多潛能基因的研究已成為熱點〔6〕,但對Nanog等因子的調(diào)控機制研究較少,因此本文基于Nanog信號通路探究miR-328對乳腺癌干細胞分化及間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制。

1 材料和方法

1.1細胞與組織標本來源 人乳腺癌干細胞購自上海圻明生物科技有限公司,選取秦皇島市第四醫(yī)院2019年1月至2020年1月的10例經(jīng)彩色多普勒超聲診斷的乳腺癌患者癌組織標本與10例癌旁組織標本,平均年齡(49.37±5.22)歲,病例術(shù)前均未進行放療、化療及其他輔助治療?；颊弑救送鈪⒓颖敬螌嶒?。

1.2主要實驗試劑與儀器 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(濟南程騰生物技術(shù)有限公司,型號:MA-6000),結(jié)晶紫染色液(廈門金瑞博生物科技有限公司,產(chǎn)品型號:JRBGL4S),噻唑藍(MTT)試劑(北京百奧萊博生物技術(shù)有限公司,貨號BTN111105-SAC),基質(zhì)膠(廣州勝欣科技有限公司,貨號:180608),信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3、p-STAT3、Nanog(武漢愛美捷科技有限公司,產(chǎn)品貨號:A-AO1236a),羊抗鼠IgG二抗(上海群己生物科技有限公司,貨號:PAB9337)。

1.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素及10 μg/ml胰島素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人乳腺癌干細胞,在37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待細胞生長至85%時,用0.25%胰酶進行細胞消化、傳代。

miR-328的轉(zhuǎn)染:在6孔板中接種即將要轉(zhuǎn)染的細胞,待細胞長至75%時,采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染50 nmol/L相應(yīng)的 mimics(模擬物)、siRNA(抑制物)及陰性對照(miR-328-NC),繼續(xù)培養(yǎng)3 d。實驗分為乳腺癌組(乳腺癌干細胞)、NC組(乳腺癌轉(zhuǎn)染miR-328-NC)、模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-328 mimics)、抑制物組(轉(zhuǎn)染miR-328 siRNA)。

1.4實時熒光定量(RT-q)PCR檢測miR-328、E-鈣黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、波形蛋白(Vimentin) 取癌組織、癌旁組織標本及各組乳腺癌干細胞,Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進行熒光反應(yīng)實驗。實驗步驟嚴格按照儀器及試劑說明書進行,PCR 條件:94 ℃ 10 min(預(yù)變性),94 ℃ 10 s(變性),60 ℃ 10 s(退火),72 ℃ 10 s(延伸),40個循環(huán),miRNA以U6作內(nèi)參,取得到的平均值后得到Ct值,計算方法用2-ΔΔCt法進行分析,引物序列及長度為:miR-328正向5′-TGGTACTGCTGGCCCTCTCT-3′,反向5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′,141 bp;E-cadherin正向5′-AAGGCACAGCCTGTCGAAGCA-3′,反向5′-AC GTTGTCCCGGGTGTCATCCT-3′,167 bp;N-cadherin正向5′-TGCGCGTGAAGGTTTGCCAGTC-3′,反向5′-TGGCGTTCTTTATCCCGGCGT-3′,175 bp;Vimentin正向5′-ACCGCACACAGCAAGGCGAT-3′,反向5′-CGATTGAGGGCTCCTAGCGGTT-3′,132 bp;U6正向5′-AGTGTCTCCTCTGGGCCCTT-3′,反向5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′,322 bp。

1.5細胞克隆實驗 取各組細胞以1×105個/ml接種于6孔板中,在37 ℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng),2 d換1次培養(yǎng)基,7 d 后棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 2 次,4% 多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌2次,0.2% 結(jié)晶紫染色15 min,PBS洗滌2次,對細胞集落數(shù)計數(shù),計算各組細胞的相對細胞克隆形成數(shù)量。

1.6MTT法檢測各組乳腺癌干細胞增殖抑制率 取各組細胞以密度3×104個/ml后接種到48孔板中,在37.0 ℃、5%CO2的條件下進行常規(guī)培養(yǎng)48 h,加 MTT 試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,使用酶標儀測吸光度(OD)值,并計算增殖率。

1.7Transwell檢測侵襲能力 取各組細胞以1×105個/ml接種于6孔板中,在37.0 ℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h,將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入到上層小室,細胞懸液加入上室,胎牛血清培養(yǎng)基加入下室,37.5 ℃條件下,培養(yǎng)2 d,取出培養(yǎng)基,每孔加入500 μl結(jié)晶紫,染色30 min,PBS洗滌后,稍晾干,顯微鏡觀察并計數(shù)。

1.8Transwell檢測遷移能力 取各組細胞以1×105個/ml接種于6孔板中,在37.0 ℃、5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)24 h,不進行鋪膠處理,細胞懸液加入上室,胎牛血清培養(yǎng)基加入下室,37.5 ℃條件下,培養(yǎng)2 d,取出培養(yǎng)基,每孔加入500 μl結(jié)晶紫,染色30 min,PBS洗滌后,稍晾干,顯微鏡觀察并計數(shù)。

1.9Western印跡檢測STAT3、p-STAT3、Nanog蛋白表達 取各組細胞進行消化,然后重懸細胞,離心后棄掉上清液,再次重懸,將濃度調(diào)整為1×106個/ml后,將其接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h,加入0.5 ml三乙醇胺鹽溶液(TNE)細胞裂解液裂解15 min,4 ℃ 12 000 r/min條件下,離心10 min,取上清液,加入蛋白上樣緩沖液,沸水浴5 min后,用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒進行電泳,電泳條件為300 V,電泳20 min后進行轉(zhuǎn)膜、封閉后,按照說明書以適當比例稀釋,加入稀釋的STAT3、p-STAT3、Nanog的一抗(1∶1 000),4 ℃搖床振蕩孵育過夜后洗膜;加入稀釋的二抗(1∶5 000),37 ℃輕搖室溫孵育2 h;洗膜后,用電化學(xué)發(fā)光(ECL)熒光試劑盒測定結(jié)果,計算與GAPDH比值求得STAT3、p-STAT3、Nanog蛋白的相對表達含量。另設(shè)立STAT3/Nanog抑制劑組:取各組乳腺癌干細胞與STAT3/Nanog抑制劑JSI-124共培養(yǎng),3 d后進行實驗;STAT3/Nanog激動劑組:取各組乳腺癌干細胞與0.5 μmol/L STAT3/Nanog激活劑Colivelin共培養(yǎng),3 d后進行實驗。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、配對t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-328表達 乳腺癌組織中miR-328表達水平(0.58±0.04)顯著低于癌旁組織(1.00±0.00;P<0.05)。乳腺癌組與NC組miR-328表達水平(1.00±0.00、1.02±0.03)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組相比,抑制物組miR-328表達水平(0.37±0.05)明顯降低,模擬物組miR-328表達水平(1.43±0.14)明顯升高(均P<0.05)。

2.2miR-328對乳腺癌干細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達的影響 乳腺癌組、NC組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);與乳腺癌組相比,模擬物組E-cadherin mRNA表達明顯升高,N-cadherin、Vimentin mRNA表達明顯降低(P<0.05);抑制物組E-cadherin mRNA表達明顯降低,N-cadherin、Vimentin mRNA表達明顯升高(P<0.05),見表1。

表1 各組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA表達水平、細胞增殖率、克隆形成率、侵襲及遷移數(shù)量對比

2.3miR-328對乳腺癌干細胞增殖、克隆形成的影響 乳腺癌組與NC組細胞增殖率、克隆形成率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌相比,模擬物組細胞增殖率、克隆形成率明顯降低,抑制物組細胞增殖率、克隆形成率明顯升高(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組細胞克隆形成(結(jié)晶紫染色)

2.4miR-328對各組乳腺癌干細胞侵襲、遷移的影響 乳腺癌組與NC組細胞侵襲及遷移數(shù)量對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組相比,模擬物組細胞遷移及侵襲數(shù)量顯著降低,抑制物組細胞遷移及侵襲數(shù)量顯著升高(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 miR-328對各組乳腺癌干細胞侵襲及遷移數(shù)量的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

2.5miR-328對STAT3、p-STAT3、Nanog蛋白表達的影響 乳腺癌組與NC組STAT3、p-STAT3、Nanog、MUC-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與乳腺癌組相比,模擬物組STAT3、p-STAT3、Nanog、MUC-1蛋白表達明顯降低(P<0.05),抑制物組STAT3、p-STAT3、Nanog、MUC-1蛋白表達明顯升高(P<0.05);STAT3/Nanog抑制劑組與模擬物組以上指標水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),STAT3/Nanog激活劑組與抑制物組以上指標水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),見表2、圖3。

1～6:乳腺癌組、NC組、模擬物組、抑制物組、STAT3/Nanog抑制劑組、STAT3/Nanog激活劑組圖3 Western印跡檢測各組細胞中STAT3、p-STAT3、Nanog、MUC-1蛋白表達

表2 各組細胞STAT3、p-STAT3、Nanog蛋白表達對比

3 討 論

研究表明〔7〕,STAT3/Nanog通路在肝臟腫瘤干細胞中被顯著激活,從而導(dǎo)致致瘤性和干性。肖金成等〔8〕研究提示,通過抑制STAT3/Nanog信號通路可抑制肝癌細胞增殖及遷移。STAT3是胚胎干細胞自我更新增殖和分化過程中重要信號通路。STAT3磷酸化(p-STAT3)激活后能夠直接啟動Nanog的轉(zhuǎn)錄,以維持干細胞自我更新,保持其未分化狀態(tài)〔9,10〕。此外,抑制Nanog表達后,乳腺癌細胞增殖,克隆、轉(zhuǎn)移被抑制,提示Nanog可作為腫瘤治療的潛在靶點〔11,12〕。miR-328 在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達明顯下調(diào)〔13,14〕。miR-328 可抑制胃癌細胞癌變〔15〕和慢性髓系白血病的進展〔16〕。本實驗結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染miR-328模擬物后,可通過抑制STAT3/Nanog通路,抑制乳腺癌干細胞的增殖及克隆形成。研究表明〔17〕,腫瘤細胞具有分化潛能,但其常出現(xiàn)分化缺失、阻斷和異?，F(xiàn)象,從而使其具有不死性,促使腫瘤細胞分化,進而促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,而將癌細胞誘導(dǎo)分化成為正常細胞,是一種不直接殺死癌細胞的治療腫瘤方法。MUC-1是一種跨膜蛋白,是一種分化標志物,在許多腫瘤組織細胞中表達,在乳腺癌組織中表達異常升高,可作為乳腺癌干細胞的分化標志〔18〕。戴少華等〔19〕研究顯示,MUC-1是乳腺癌細胞分化的標志,MUC-1表達降低提示誘導(dǎo)乳腺癌細胞分化。本實驗結(jié)果提示,miR-328可能通過抑制STAT3/Nanog通路后抑制MUC-1表達,從而誘導(dǎo)乳腺癌干細胞分化。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多步驟的過程。研究表明〔20〕,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可使癌細胞獲得更強的遷移能力,與癌癥的轉(zhuǎn)移相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認為可以幫助癌細胞突破基底膜和基質(zhì),逃逸至血管、淋巴管,從而有利于其逃避凋亡,重塑新的轉(zhuǎn)移灶。腫瘤干細胞由于具有自我更新、多向分化、無限增殖及轉(zhuǎn)移潛能的特性,也被認為是腫瘤進展的關(guān)鍵因素之一。本實驗結(jié)果提示,高表達的miR-328可抑制乳腺癌干細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移,這與汪祖益等〔21〕研究結(jié)果相似。另有研究顯示〔22〕,誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化會下調(diào)上皮標志物E-cadherin表達,上調(diào)N-cadherin、Vimentin表達。劉洪濤等〔23〕研究顯示,通過抑制N-cadherin表達,促進E-cadherin表達,從而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,抑制乳腺癌細胞的侵襲及遷移。本實驗結(jié)果提示,miR-328參與乳腺癌干細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。