王韜 費(fèi)建東 聶雙發(fā) 李磊

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胃腸外科,河北 張家口 075000)

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤,是一種嚴(yán)重威脅生命健康的疾病,其發(fā)病率和病死率逐年上升〔1〕?；熉?lián)合結(jié)腸癌根治術(shù)是治療結(jié)腸癌的常用手段,化療藥物主要包括卡培他濱、奧沙利鉑、氟尿嘧啶等。研究顯示,術(shù)后單獨(dú)采用化療藥物治療結(jié)腸癌對(duì)提高患者術(shù)后生存率的效果并不理想,故嘗試聯(lián)合用藥方式迫在眉睫〔2〕。薏苡仁油是從薏苡仁中提取的活性成分,具有多種用藥效果,包括減少腹部脂肪,抗腫瘤,提高免疫力等〔3,4〕,在多種癌癥的化療聯(lián)合治療中,均可提高腫瘤治療效果,減輕不良反應(yīng),同時(shí)改善患者生活質(zhì)量,但其發(fā)揮凋亡作用的具體機(jī)制尚未完全明確〔5,6〕。本研究探討薏苡仁油聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與細(xì)胞株 人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞株購于瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心;注射用薏苡仁油,浙江康萊特藥業(yè)公司,批號(hào)1503163-1;胎牛血清,美國Gibco公司,批號(hào)16000-044;RPMI1640培養(yǎng)基,美國Gibco公司;奧沙利鉑,杭州中美華東制藥有限公司,批號(hào)150403;碘化丙啶(PI),美國Sigma公司,批號(hào)MKBP1360V;膜聯(lián)蛋白(Annexin)-Ⅴ/PI凋亡試劑,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào)1030D057;甲基唑藍(lán),美國Sigma公司,批號(hào)M2128。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞置于含雙抗、含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,同時(shí)在溫度為37 ℃,含有5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),選擇對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞完成實(shí)驗(yàn)。

1.3四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞增殖情況 實(shí)驗(yàn)分組:以注射用薏苡仁油濃度為依據(jù),將其分為薏苡仁油10、20、40 μl/ml組、奧沙利鉑組(50 μl/ml)、奧沙利鉑組+薏苡仁油10 μl/ml、奧沙利鉑+薏苡仁油20 μl/ml組、奧沙利鉑+薏苡仁油40 μl/ml組、空白對(duì)照組。將細(xì)胞按照每孔2×104的標(biāo)準(zhǔn)在96孔培養(yǎng)板中接種,等到細(xì)胞貼壁之后,實(shí)驗(yàn)組將以上各種細(xì)胞藥物加入,空白對(duì)照組加入等體積生理鹽水,每組均設(shè)置副孔6個(gè);藥物分別培養(yǎng)24、48及72 h,在避光條件下分別將20 μl MTT加入每孔中,行4 h孵育之后,將MTT與培養(yǎng)基去除,分別將150 μl二甲基亞砜(DMSO)加入每孔中,行5 min震蕩處理,對(duì)各孔吸光度值(OD)進(jìn)行測定,細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%,細(xì)胞抑制率嚴(yán)格按照公式進(jìn)行計(jì)算,行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),最終結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況 對(duì)實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組行48 h培養(yǎng)之后的HT-29細(xì)胞進(jìn)行收集,按照1 000 r/min的速度行5 min離心處理,將上清液去除,采用磷酸緩沖液(PBS)行2次漂洗,將PI、AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)染液加入,混勻之后在4 ℃的環(huán)境下行15 min避光染色處理,最后再上機(jī)分析檢測熒光強(qiáng)度。

1.5RT-PCR法測定Survivin表達(dá)水平 對(duì)用藥前后的結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行收集,對(duì)細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取,嚴(yán)格按照試劑盒說明書行擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄操作,選擇PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,同時(shí)在紫外燈下進(jìn)行攝影。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比 薏苡仁油組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑+薏苡仁油組均會(huì)對(duì)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖產(chǎn)生一定抑制作用,且薏苡仁油濃度越高,作用時(shí)間越長,細(xì)胞增殖抑制率越高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與薏苡仁油組、奧沙利鉑組相比,奧沙利鉑+薏苡仁油組細(xì)胞增殖抑制率更高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Survivin mRNA表達(dá)對(duì)比

2.2各組人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡率對(duì)比 薏苡仁油組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑+薏苡仁油組細(xì)胞凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05);薏苡仁油濃度越高,細(xì)胞凋亡率也越高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);奧沙利鉑+薏苡仁油組細(xì)胞凋亡率高于單獨(dú)奧沙利鉑組、薏苡仁油組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

2.3奧沙利鉑聯(lián)合薏苡仁油對(duì)HT-29細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)的影響 薏苡仁油各濃度組Survivin mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.05);與空白對(duì)照組對(duì)比,奧沙利鉑組Survivin mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯提高(P<0.05);奧沙利鉑+薏苡仁油組Survivin mRNA表達(dá)強(qiáng)度較單獨(dú)奧沙利鉑組明顯降低(P<0.05),見表1。

3 討 論

結(jié)腸癌是我國乃至全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率都較高的惡性腫瘤之一,主要的治療方式包括靶向治療、放化療、手術(shù)等,然而受傳統(tǒng)觀念影響和醫(yī)療條件的限制,我國結(jié)腸癌患者的早期就診率低,誤診率高,中晚期病例較多,手術(shù)結(jié)合化療是結(jié)腸癌的主要治療手段之一〔7〕。奧沙利鉑為臨床治療結(jié)腸癌的常見化療藥物,單獨(dú)用藥效果不理想,極易產(chǎn)生耐藥性〔8〕。薏苡仁油是從薏苡仁中提取出來的一種有效成分,具有清熱排膿、舒筋除痹、健脾去濕、利水消腫功效〔9〕。以薏苡仁油為主要成分的抗腫瘤藥物康萊特注射液已經(jīng)在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。薏苡仁油能對(duì)T淋巴細(xì)胞活性、細(xì)胞因子水平進(jìn)行調(diào)節(jié),促使機(jī)體免疫功能提高;對(duì)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)行干擾,對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制,對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo);該藥物還能對(duì)血管形成、血管內(nèi)皮生長因子蛋白陽性表達(dá)進(jìn)行抑制,進(jìn)而避免腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移〔10～12〕。

本研究結(jié)果提示,薏苡仁油不僅能對(duì)HT-29細(xì)胞生長進(jìn)行抑制,同時(shí)還能進(jìn)一步提高奧沙利鉑對(duì)HT-29細(xì)胞活性、增殖的抑制作用,并具有時(shí)間-劑量依賴性特點(diǎn)。楊穎等〔13〕研究顯示,薏苡仁能促使吉西他濱抑制人肝癌細(xì)胞增殖的作用進(jìn)一步增強(qiáng)。盧立欣等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),在腹腔灌注化療基礎(chǔ)上聯(lián)合薏苡仁能對(duì)惡性腹腔積液的產(chǎn)生起明顯抑制作用。以上結(jié)果均與本研究結(jié)果高度相似,進(jìn)一步證明薏苡仁能增強(qiáng)化療效果,對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制。與此同時(shí),通過對(duì)比不同組腫瘤細(xì)胞凋亡情況得知,注射用薏苡仁油濃度越高,細(xì)胞凋亡率也越高;聯(lián)合奧沙利鉑與注射用薏苡仁油治療結(jié)腸癌利于發(fā)揮藥物協(xié)同作用,進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,其作用機(jī)制可能和Survivin mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)存在密切相關(guān)性。Survivin屬于一種凋亡抑制蛋白,只表達(dá)于腫瘤和胚胎組織,且與腫瘤細(xì)胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),同時(shí)參與腫瘤細(xì)胞化療抵抗〔15〕。研究顯示,Survivin高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞逃避凋亡,進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性的重要原因〔16〕。對(duì)腫瘤細(xì)胞中的Survivin表達(dá)進(jìn)行抑制,不僅能對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行誘導(dǎo),同時(shí)還能促使化療效果進(jìn)一步增強(qiáng)。本研究提示,注射用薏苡仁油能在一定程度上抑制Survivin表達(dá);奧沙利鉑可能對(duì)HT-29細(xì)胞中Survivin高表達(dá)具有誘導(dǎo)作用,這也是HT-29細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑具有耐藥性的重要原因之一;注射用薏苡仁油不僅能促使HT-29細(xì)胞中的Survivin mRNA表達(dá)強(qiáng)度降低,同時(shí)也能促使奧沙利鉑誘導(dǎo)的Survivin高表達(dá)降低,推測這可能是薏苡仁油提高HT-29細(xì)胞對(duì)藥物奧沙利鉑敏感性的重要機(jī)制。

綜上所述,薏苡仁油聯(lián)合奧沙利鉑可協(xié)同發(fā)揮對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用,并協(xié)同發(fā)揮對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,其作用機(jī)制可能和Survivin表達(dá)有密切相關(guān)性,但仍需進(jìn)一步探討是否存在其他作用機(jī)制。