陳林金 謝應(yīng)玉 陳丹 林師雅 姜靖雯

(海南省中醫(yī)院,海南 ?？?571500)

結(jié)腸癌好發(fā)于40歲以上患者,且男性患者多于女性。結(jié)腸癌發(fā)病率較高,在所有惡性腫瘤中排名前三,有資料顯示,結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年升高且呈年輕化趨勢〔1～3〕。目前對于結(jié)腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明晰,但可能與飲食習(xí)慣、生活環(huán)境、遺傳因素等有關(guān)〔4〕,臨床治療以傳統(tǒng)的手術(shù)聯(lián)合放化療為主,但患者術(shù)后的5年生存率始終較低,且手術(shù)會(huì)對患者身體造成極大的損害,嚴(yán)重影響了患者術(shù)后的生活質(zhì)量〔5,6〕。近年來,隨著中醫(yī)藥的深入研究及廣泛應(yīng)用,中藥的抗腫瘤作用逐步受到關(guān)注。槲皮素是具有多種生物活性的多羥基黃酮類化合物,廣泛存在于植物界中,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素在抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管等方面均具有一定的治療效果〔7,8〕,對癌癥的進(jìn)展具有顯著的抑制作用〔9,10〕。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過降低白細(xì)胞介素(IL)-6、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)的表達(dá)影響結(jié)腸癌的發(fā)展〔11,12〕,而酪氨酸蛋白激酶(JAK)是STAT通路的上游關(guān)鍵因子,JAK/STAT通路是介導(dǎo)癌癥發(fā)生發(fā)展的重要通路〔13〕。本研究主要基于JAK/STAT通路探討槲皮素對IL-6的影響,并分析其對結(jié)腸癌大鼠的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購買40只雄性C57BL/6小鼠〔許可證SCXK(鄂)2019-0001,武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司〕,體質(zhì)量(20±2)g,周齡為5～6 w。將所有小鼠隨機(jī)分為4組,分別為對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組(槲皮素低、槲皮素高),每組各10只。

1.2試劑與儀器 槲皮素(貨號Q4951,純度≥95%)、氧化偶氮甲烷(AOM,貨號A5486,純度≥98%)均購自美國Sigma公司;葡萄糖硫酸鈉鹽(DSS,貨號60316ES25)購自上海翌圣生物科技有限公司;蘇木素-伊紅(HE)染液(貨號G1120)購自北京索萊寶科技有限公司;IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號AD40133、AD40104、AD40155)均購自武漢艾迪抗生物科技有限公司;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒(貨號AAT-B22844)購自上海齊源生物科技有限公司;兔源Ki67一抗(貨號ab15580)、兔源單克隆半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9一抗(貨號ab32539)、兔源單克隆p-JAK(貨號ab195055)、兔源單克隆p-STAT3一抗(貨號ac267373)、山羊抗兔多克隆lgG二抗(貨號ab150077)均購自英國Abcam公司;BL2200H型電子天平(日本津島儀器公司);GS-15R型離心機(jī)(美國Beckman公司);BIOBASE-EL10A型酶標(biāo)儀(山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司);CX23型生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3造模及藥物干預(yù) 所有小鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,除對照組外其余3組均構(gòu)建結(jié)腸癌模型〔14〕。本實(shí)驗(yàn)符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。造模:第1天在小鼠腹腔注射AOM溶液(10 mg/kg),給予常規(guī)飲水持續(xù)1 w,再給予2.5%DSS溶液代替飲用水持續(xù)喂養(yǎng)1 w(每2 d需更換一次DSS溶液),繼續(xù)給予常規(guī)飲水持續(xù)1 w,此過程為1個(gè)DSS循環(huán)周期,共需進(jìn)行3個(gè)DSS循環(huán)周期,當(dāng)小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍,糞便帶血或黏液物質(zhì)時(shí)表示建模成功。對照組以生理鹽水灌胃,正常喂養(yǎng)。藥物干預(yù):建模成功后,實(shí)驗(yàn)組(槲皮素低、高劑量組)分別給予槲皮素(20、80 mg/kg)灌胃持續(xù)4 w,對照組及模型組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.4檢測指標(biāo) ①采用電子天平,分別記錄各組小鼠造模前、造模成功后及末次給藥后小鼠的體質(zhì)量變化情況;②3組經(jīng)水合氯醛腹腔麻醉后,抽取腹腔主動(dòng)脈血5 ml,3 000 r/min下進(jìn)行離心10 min,取上清液血清。分別采用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測小鼠血清中的炎癥因子TNF-α、IL-6、IFN-γ的水平,操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作;③處死小鼠,取出小鼠結(jié)腸組織,測量結(jié)腸長度,并計(jì)算結(jié)腸組織上可見的腫瘤數(shù)量;④取部分結(jié)腸空腸組織制成石蠟切片,HE染色觀察其病理結(jié)構(gòu);⑤取部分結(jié)腸組織,采用TUNEL檢測試劑盒觀察細(xì)胞凋亡情況,顯微鏡下細(xì)胞核內(nèi)顯棕色細(xì)胞即凋亡細(xì)胞,細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%;⑥采用Western印跡法檢測小鼠結(jié)腸組織中p-JAK、p-STAT、Ki67、Caspase-9蛋白表達(dá)水平,取部分結(jié)腸組織提取總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度,取等量蛋白樣品用進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濕法將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉在室溫的條件下封閉1 h,加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜后加入二抗lgG(1∶5 000),室溫條件下孵育1 h,顯色顯影,以β-actin為內(nèi)參蛋白,計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組體質(zhì)量變化 造模前,各組體質(zhì)量比較無顯著差異(P>0.05);造模成功后,與對照組相比,模型組、槲皮素低、高劑量組體質(zhì)量均明顯降低(P<0.05);末次給藥后,與模型組相比,槲皮素給藥組體質(zhì)量均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組造模前、造模成功后及末次給藥后體質(zhì)量及血清炎癥因子水平比較

2.2各組血清炎癥因子水平 與對照組相比,模型組、槲皮素低、高劑量組血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平均明顯升高(P<0.05);與模型組相比,槲皮素給藥組血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明顯降低(P<0.05),且隨槲皮素使用劑量增加,炎癥因子IL-6、TNF-α、IFN-γ降低越明顯。見表1。

2.3各組結(jié)腸長度及腫瘤數(shù)量比較 與對照組相比,模型組、槲皮素給藥組結(jié)腸長度明顯減少、結(jié)腸上腫瘤數(shù)量明顯增加(P<0.05);與模型組相比,槲皮素給藥組結(jié)腸長度明顯增加、結(jié)腸上腫瘤數(shù)量明顯減少(P<0.05)。見表2。

表2 各組結(jié)腸長度、腫瘤數(shù)、細(xì)胞凋亡率、Ki67、Caspase-9、p-JAK、p-STAT蛋白比較

2.4各組結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況比較 與對照組相比,模型組、槲皮素給藥組結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05);與模型組相比,槲皮素給藥組結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組結(jié)腸組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

2.5各組結(jié)腸組織Ki67、Caspase-9、p-JAK、p-STAT蛋白表達(dá)比較 與對照組相比,模型組、槲皮素給藥組結(jié)腸組織中促癌蛋白Ki67表達(dá)、p-JAK、p-STAT表達(dá)水平明顯升高,促凋亡蛋白Caspase-9表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,槲皮素給藥組結(jié)腸組織中促癌蛋白Ki67表達(dá)、p-JAK、p-STAT表達(dá)水平明顯降低,促凋亡蛋白Caspase-9表達(dá)明顯升高(均P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組結(jié)腸組織Ki67、Caspase-9、p-JAK、p-STAT蛋白表達(dá)

2.6各組結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)比較 對照組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞排列整齊,杯狀細(xì)胞完整清晰,隱窩較淺;模型組結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)整體被破壞,上皮細(xì)胞大量脫落,杯狀細(xì)胞數(shù)量減少,隱窩加深且無法辨別,存在炎性細(xì)胞浸潤;與模型組相比,槲皮素給藥組結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)明顯改善。見圖3。

圖3 各組結(jié)腸組織病理結(jié)構(gòu)(HE染色,×200)

3 討 論

結(jié)腸癌作為一種臨床常見惡性腫瘤,其逐年攀升的發(fā)病率引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視,對于抗結(jié)腸癌腫瘤藥物方面的研究受到了廣泛關(guān)注。槲皮素具有廣泛的生物活性,研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤均具有明顯的拮抗作用〔15,16〕。王惠麗等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),槲皮素能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長及遷移,提示槲皮素對結(jié)腸癌具有明顯的治療作用。

持續(xù)性的炎癥反應(yīng)是促進(jìn)腫瘤發(fā)展進(jìn)程的重要影響因素,而IL-6是機(jī)體內(nèi)重要的促炎因子,是調(diào)節(jié) 細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞因子,IL-6可激活機(jī)體內(nèi)一系列的炎癥聯(lián)合反應(yīng)。TNF-α、IFN-γ均是炎癥反應(yīng)中涉及的炎癥因子,其中TNF-α是處于腫瘤微環(huán)境中的促炎因子,TNF-α可誘導(dǎo)DNA突變、癌細(xì)胞惡性增殖,與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān);IFN-γ主要參與自身免疫應(yīng)答反應(yīng)及炎癥反應(yīng),與腸道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可通過抑制結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng),抑制結(jié)腸炎小鼠進(jìn)一步發(fā)展為結(jié)腸癌〔18〕,提示炎癥反應(yīng)是槲皮素保護(hù)結(jié)腸癌小鼠的重要作用機(jī)制。IL-6可通過激活JAK/STAT通路發(fā)揮炎癥因子作用,JAK/STAT通路又可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)影響IL-6的分泌,研究發(fā)現(xiàn)IL-6通過JAK/STAT通路參與結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程〔19〕,進(jìn)一步證明IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮重要作用,而槲皮素可能通過抑制IL-6得到表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。

本研究說明,結(jié)腸癌能夠顯著減弱小鼠的腸道吸收功能,使用槲皮素后能夠改善結(jié)腸癌小鼠的腸道吸收能力。與蔡劍輝等〔12〕研究結(jié)果相吻合,本文驗(yàn)證了槲皮素通過調(diào)控IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程。本研究提示,槲皮素通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑癌作用。槲皮素可能通過抑制JAK/STA通路表達(dá),進(jìn)一步抑制其下游通路蛋白,影響結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程。