王樹(shù)根 寧美英 楊曉暉 李夢(mèng)冉 馬曉迎 李然

(1滄州市中心醫(yī)院藥學(xué)部,河北 滄州 061000;2滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)中心;3滄州師范學(xué)院生物系)

1 資料與方法

1.1材料 膽固醇、膽酸鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),丙基硫氧嘧啶(薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司),吐溫 80(上海麥克林生化有限公司),豬油(臨沂新程金鑼肉制品有限公司),TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所),4%中性甲醛溶液、蘇木素、曙紅Y(北京索萊寶科技有限公司),TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(生物工程上海有限公司),ROX Reference Dye(廣州碩恒生物科技有限公司),Trizol(Invitrogen),高效切片石蠟(上海華永石蠟有限公司)其他化學(xué)試劑(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司),MG-Na(實(shí)驗(yàn)室自制,純度≥95%),普羅布考片(250 mg,頸復(fù)康藥業(yè))。

1.2儀器與設(shè)備 RBP-1B型光電法鼠尾血壓測(cè)定分析系統(tǒng)(中日友好醫(yī)院),MICROM HM 325 scientific型石蠟切片機(jī)、Thermo Fisher Scientific石蠟包埋機(jī)(美國(guó)賽默飛),ZEISS Primo Start型顯微鏡(德國(guó)蔡司),AU480型全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó) Beckman Coulter 公司),ZL6000C型全自動(dòng)血流變測(cè)試儀(北京眾馳),79HW-1 恒溫磁力攪拌器(江蘇金成實(shí)驗(yàn)儀器有限公司),電子天平(上海精其),DYY-Ⅲ-8B 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海納識(shí)生物),GDS凝膠成像分析系統(tǒng)(法國(guó) Bio-Profil)Step One Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems),Multiskan MK3 酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Sci entific 公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠60只,雄性,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔SCXK(京)2016-0006〕。飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SYXK(冀)2019-006〕,飼養(yǎng)環(huán)境屏障級(jí)。所有操作符合滄州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)要求〔意見(jiàn)號(hào):2021-174-01(Z)〕。

1.4脂肪乳劑制備 取豬油攪拌在燒杯中攪拌加熱,待溫度升到 100 ℃時(shí),依次加入膽固醇、丙硫氧嘧啶,三者比例為5∶2∶0.2,充分?jǐn)噭?然后加適量入吐溫-80,制成油相。同時(shí)在另一燒杯中加入蒸餾水和丙二醇二者比例為3∶2,放在電爐上加熱至60 ℃,然后加入適量去氧膽酸鈉,充分?jǐn)嚢柚钡酵耆芙?制成水相。然后將水相與油相按照2∶1的比例充分混勻,即制成脂肪乳劑〔11〕。灌胃造模時(shí)將配好的脂肪乳劑與雙蒸水1∶1稀釋。

1.5分組、造模及給藥 所有SD大鼠在屏障級(jí)環(huán)境下,基礎(chǔ)飼料應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。將60只SD大鼠稱重標(biāo)記后隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、MG組、MG-Na低劑量組、MG-Na高劑量組,每組10只。正常組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。其余各組在基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的同時(shí)采取脂肪乳灌胃法建立大鼠高血脂模型,灌胃容積為1 ml/kg,1次/d,連續(xù)喂養(yǎng)8 w〔11〕。造模同時(shí)灌胃給藥,分別為陽(yáng)性對(duì)照組(普羅布考片500 mg/kg)、MG組(80 mg/kg)、MG-Na低量組(40 mg/kg)及高劑量組(80 mg/kg)。正常組及模型組給予同體積的蒸餾水灌胃。

1.6體質(zhì)量變化 末次給藥后,稱量各組大鼠體質(zhì)量并記錄。

1.7大鼠尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)第4、8周末次給藥后60 min,將大鼠至于(37±0.5)℃恒溫箱30 min,使大鼠尾動(dòng)脈擴(kuò)張后連接鼠尾血壓測(cè)定分析系統(tǒng)。待大鼠行為穩(wěn)定后,打開(kāi)測(cè)定分析系統(tǒng),測(cè)定大鼠尾動(dòng)脈收縮壓,連續(xù)測(cè)3次,每次間隔約1 min,以均值作為收縮壓值。

實(shí)踐教育基地建設(shè)是不僅將學(xué)校資源與企業(yè)資源相融合，充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)，每一個(gè)需要，合作是雙贏的，也是符合我們學(xué)校建立“三位一體”人才培養(yǎng)模式，即：“學(xué)校，企業(yè)，研究機(jī)構(gòu)”三位一體的教育主題?“，“常識(shí)科，專業(yè)課程，職業(yè)課程”Trinity課程體系，“學(xué)習(xí)，使用和創(chuàng)造”三位一體的培訓(xùn)方法。這種方法在促進(jìn)學(xué)校，教師，學(xué)生和企業(yè)方面發(fā)揮了積極作用?！敖虒W(xué)與學(xué)習(xí)緊密結(jié)合，理論與實(shí)踐緊密結(jié)合，學(xué)校與企業(yè)緊密結(jié)合”教育模式積極適應(yīng)并大力發(fā)展人才就業(yè)市場(chǎng)，創(chuàng)造本土應(yīng)用型創(chuàng)新型人才模范。

1.8血清血脂水平檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)第8周末次給藥后,大鼠禁食不禁水12 h后,眼眶后靜脈叢采血約1 ml,血樣經(jīng)室溫靜置,自然凝固,低溫離心(4 ℃,3 000 r/min,10 min)等預(yù)處理后取上層血清按照TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)。

1.9血清氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和MDA檢測(cè) 按照1.8中方法大鼠取血,血樣預(yù)處理后取上層血清按照SOD和MDA試劑盒說(shuō)明操作檢測(cè)。

1.10血液全血黏度檢測(cè) 大鼠麻醉后,用肝素抗凝采血管下腔靜脈取血,4 h內(nèi)檢測(cè)高(黏度200/s)、中(黏度100/s)、低(黏度30/s)3個(gè)切值下全血黏度。

1.11肝組織病理學(xué)檢查 大鼠麻醉后,經(jīng)斷頸處死動(dòng)物,取出整個(gè)肝臟并去除包膜,濾紙吸干血液,稱全肝質(zhì)量即肝濕質(zhì)量。肝臟指數(shù)(%)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。用甲醛溶液將取出肝臟固定,用刀片切取3～5 mm邊緣齊整的組織經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、組織切片、常規(guī)脫蠟、HE染色、脫水及封片后,在光學(xué)顯微鏡下觀察、攝像。

1.12主動(dòng)脈油紅O染色觀察 固定住大鼠頭尾,沿主動(dòng)脈方向慢慢地縱向剪開(kāi),邊剪邊固定,最終使主動(dòng)脈整個(gè)內(nèi)腔面平鋪朝上。用現(xiàn)配好的油紅O溶液對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)腔面進(jìn)行染色,經(jīng)75% 乙醇浸洗后用數(shù)碼相機(jī)拍攝圖像。

1.13定量PCR法檢測(cè)血管組織中細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1和血管細(xì)胞黏附因子(VCAM)-1 mRNA表達(dá) 用Trizol提取血管組織中的總RNA,測(cè)定其濃度。TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以β-肌動(dòng)蛋白(actin)為內(nèi)參。配制反應(yīng)混合液,總反應(yīng)體系20 μl:SuperReal PreMix Plus 10 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μl,cDNA 100.0 ng,ROX Reference Dye 0.4 μl使用RNase-Free ddH2O稀釋至20 μl。反應(yīng)條件:95 ℃ 15 min;在按照95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環(huán)40次。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。PCR引物設(shè)計(jì):ICAM-1正義鏈:GGCAGCCTCTTATGTTTAT、反義鏈:GCTTGTCCCTTGAGTTTTA,94 bp;VCAM-1正義鏈:AACCTGACCTGCTCAAGTG,反義鏈:CTCTTTGACGCTCTTAGATG,113 bp;β-actin正義鏈:GGCACCACACCTTCTAC,反義鏈:CTGGGTCATCTTTTCAC,108 bp。

1.14Western印跡檢測(cè)血管組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá) 提取樣本組織蛋白樣品,通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色成像。Qantity One分析灰度值和定量分析。

1.15統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行方差分析,兩組比較采用LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1各組日常觀察 實(shí)驗(yàn)期間各組未出現(xiàn)死亡。其中,正常組精力充沛、對(duì)外界刺激反應(yīng)良好,毛發(fā)具有光澤;其余組實(shí)驗(yàn)初期活動(dòng)正常,隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行大鼠活動(dòng)顯著減少、精神萎靡,形體肥胖,毛發(fā)油膩、缺少光澤;陽(yáng)性對(duì)照組、MG組及MG-Na給藥組生活狀態(tài)與形體較模型組好。

2.2各組體質(zhì)量及肝臟指數(shù)變化 經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,與正常組比較,模型組體質(zhì)量、肝臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,MG-Na高、低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組體質(zhì)量、肝臟指數(shù)明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組體質(zhì)量及肝臟指數(shù)、變化

2.3各組尾動(dòng)脈收縮壓變化 采取脂肪乳灌胃,建立大鼠高血脂模型。與正常組比較,實(shí)驗(yàn)4、8 w后模型組尾動(dòng)脈收縮壓明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,MG-Na高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組收縮壓明顯下降(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.4各組血清血脂變化 經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,與正常組比較,模型組血清血脂變化顯著(P<0.01),與模型組比較,MG-Na高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組TC、TG、LDL-C明顯降低,HDL-C顯著升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.5各組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和MDA變化 經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,與正常組比較,模型組血清氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD顯著降低,MDA顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組與MG-Na高劑量組SOD明顯升高,MDA明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)8 w后各組SOD、MDA、全血黏度變化

2.6各組全血黏度變化 經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,與正常組比較,模型組在高(黏度200/s)、中(黏度100/s)、低(黏度30/s)3個(gè)切值下全血黏度明顯增加(P<0.01,P<0.05)。與模型組比較,MA-Na高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組3個(gè)切值下全血黏度顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.7各組肝組織病理學(xué)變化 經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,剖取各組大鼠肝臟。通過(guò)外觀觀察,正常組肝無(wú)異常變化,外觀顏色鮮紅,無(wú)脂質(zhì)積聚在肝臟表面。與正常組比較,模型組肝臟膨大,包膜緊張,邊緣棱角消失,表面油膩,成奶黃色。與模型組比較,各給藥組肝臟外觀紅潤(rùn),肝臟膨大程度減輕,其中陽(yáng)性對(duì)照組與MG-Na高劑量組改善明顯。見(jiàn)圖1。正常組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常,排列整齊,核深染,居于正中分界清楚,肝細(xì)胞未見(jiàn)病理性改變。模型組肝細(xì)胞體積增大,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞內(nèi)大面積脂肪病變,核居于一側(cè),肝臟細(xì)胞匯管區(qū)內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),甚至出現(xiàn)壞死;胞質(zhì)內(nèi)充滿大量脂肪空泡,酷似泡沫細(xì)胞,界限不清。陽(yáng)性對(duì)照組及MG-Na高劑量組肝細(xì)胞內(nèi)匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,范圍明顯減小。見(jiàn)圖2。

圖1 各組肝臟外觀

圖2 各組肝組織病理(HE染色,×200)

2.8主動(dòng)脈油紅O染色觀察 油紅O與主動(dòng)脈斑塊中的脂質(zhì)結(jié)合,將斑塊部位染成紅色,通過(guò)紅色斑塊的面積可以直接判斷脂肪乳灌胃引起主動(dòng)脈的病變程度。經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,正常組主動(dòng)脈壁無(wú)增厚表面光滑,無(wú)明顯主動(dòng)脈斑塊產(chǎn)生。與正常組比較,模型組主動(dòng)脈壁增厚且不平整,可觀察到明顯的主動(dòng)脈斑塊。陽(yáng)性對(duì)照組及MG-Na高劑量組,主動(dòng)脈斑塊形成明顯減少。見(jiàn)圖3。

圖3 各組主動(dòng)脈(油紅O染色,100)

2.9血管組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)變化 經(jīng)過(guò)8 w的實(shí)驗(yàn)喂養(yǎng)與給藥,與正常組比較,模型組ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,MG-Na高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)水平明顯下降;MG-Na低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組ICAM-1、VCAM-1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)表3、見(jiàn)圖4。

1～5:正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、MG組、MG-Na低劑量組圖4 各組血管組織ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)

表3 實(shí)驗(yàn)8 w后各組血管組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)變化

3 討 論

中國(guó)心血管病患病人數(shù)持續(xù)上升,而血脂異常正是心血管疾病的發(fā)病基礎(chǔ)〔12〕。高脂血癥,中醫(yī)診斷是由于脾虛痰盛、肝脾不調(diào)進(jìn)而引起氣機(jī)障礙、水液代謝受阻,恣食肥甘導(dǎo)致痰積血瘀,化為脂濁〔3,13〕。高脂血癥會(huì)引起血液黏度升高、血壓升高,加速動(dòng)脈粥樣斑塊形成,進(jìn)而引起腦卒中或冠心病等的發(fā)生,降低血脂對(duì)于預(yù)防心血管疾病的發(fā)生尤為重要〔2,3〕。臨床上多采用飲食控制或結(jié)合他汀類藥物對(duì)高血脂進(jìn)行調(diào)節(jié),但此類藥物副作用大,常引起肝腎損害〔4〕。因此,開(kāi)發(fā)天然藥或其衍生物物調(diào)節(jié)血脂有著化學(xué)合成物不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

研究發(fā)現(xiàn),黃酮類MG可以提高脂蛋白酶的活性,明顯調(diào)節(jié)血脂、游離脂肪酸、左旋肉堿等水平〔14〕。前期研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)成鹽反應(yīng),制備的MG-Na的溶解度、生物利用度較MG明顯提高〔10〕。本實(shí)驗(yàn)表明,MG-Na可以有效治療高脂高熱量飲食引起的脂代謝紊亂、血壓升高。MG-Na保留了MG的多個(gè)酚羥基,這種多酚羥基結(jié)構(gòu)可以直接清除自由基,也可通過(guò)絡(luò)合鐵和銅離子抑制活性氧和自由基的生成〔5,15〕。SOD是機(jī)體內(nèi)具有抗氧化活性的物質(zhì),可以預(yù)防因氧化傷害所導(dǎo)致的各種疾病〔3,16〕;MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物,水平高低反映出脂質(zhì)過(guò)氧化程度,水平過(guò)高可引起細(xì)胞損傷〔3〕。本研究表明,MG-Na具有明顯的抗氧化作用可以降低大鼠自由基水平,調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝。

當(dāng)血液黏度增加時(shí),血液流動(dòng)速度減慢,由于缺氧導(dǎo)致血管內(nèi)基膜受損,血液中的脂肪更易沉積在血管內(nèi)壁,使血管內(nèi)壁結(jié)構(gòu)改變,從而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化疾病〔9,17〕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,MG-Na各個(gè)劑量可有效地糾正由于高脂血癥引起的血液黏稠度增高且呈劑量相關(guān)性,改善高脂血癥引起的血液流變性差的作用。

本研究結(jié)果提示,MG-Na可通過(guò)降低細(xì)胞凋亡,減輕血管炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和斑塊的形成達(dá)到保護(hù)肝臟及血管的作用。ICAM-1、VCAM-1是存在于細(xì)胞表面的一種免疫球蛋白〔18〕。在正常的血管組織中,表達(dá)極少,甚至不表達(dá)〔19〕。當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí),VCAM-1、ICAM-1通過(guò)與相應(yīng)配體相互作用,促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成,加重脂質(zhì)的沉積,促進(jìn)單核細(xì)胞遷移到血管平滑肌層,進(jìn)而加劇動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展〔20,21〕。因此,調(diào)控ICAM-1和VCAM-1活化,對(duì)于防治動(dòng)脈粥樣硬化具有積極意義。MG-Na能夠顯著降低血管組織ICAM-1和VCAM-1 mRNA的表達(dá),起到保護(hù)血管作用、減少斑塊形成,這也通過(guò)主動(dòng)脈油紅O染色觀察得到印證。