賈磊 張超 陳俊如 馮岳龍 朱瑞

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院,寧夏 銀川 750002)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的一種惡性腫瘤,大多數(shù)為移行細(xì)胞癌,具有極高的復(fù)發(fā)率和死亡率,并且復(fù)發(fā)后的膀胱癌惡性度增高、浸潤(rùn)能力增強(qiáng)〔1,2〕。目前多以化療藥物治療為主,但是患者容易產(chǎn)生耐藥性,且更容易復(fù)發(fā),因此尋找新的有效的藥物是目前亟待解決的問(wèn)題。大蒜素具有抗腫瘤、降低膽固醇和血壓、抗血小板聚集、預(yù)防心血管疾病、抵抗腫瘤等作用〔3,4〕。并且,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其對(duì)胃癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等有一定的抑制作用。還有研究指出大蒜素中所含化合物可以加速致癌物的解毒,甚至是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕。除此之外,B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)是調(diào)控細(xì)胞凋亡的核心分子〔6〕;半胱天冬酶(Caspase)是屬于白細(xì)胞介素(IL)-1轉(zhuǎn)化酶家族的,當(dāng)細(xì)胞識(shí)別到凋亡誘導(dǎo)因子的刺激時(shí),Caspase-8將做出應(yīng)答反應(yīng),啟動(dòng)細(xì)胞解體,激活下游Caspase-3促進(jìn)下游相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯,促進(jìn)細(xì)胞自殺性解體,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔7〕。但是目前關(guān)于大蒜素作用于膀胱癌細(xì)胞的具體機(jī)制并不明確,是否與Bax、裂解的(Cleaved)-Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān),尚不清楚,因此本文以膀胱癌細(xì)胞為研究對(duì)象,探討大蒜素膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,并研究其具體機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料與儀器 膀胱癌細(xì)胞株BIU-87(佰曄生物科技中心);大蒜素注射液(上海禾風(fēng)制藥有限公司);胎牛血清(FBS)、流式細(xì)胞儀(Coming公司);顯微鏡(無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)、離心機(jī)(繼譜電子科技有限公司);Matrigel膠、Transwell侵襲室(撫生實(shí)業(yè)有限公司);所需試劑盒、抗體(晶抗生物工程有限公司);酶標(biāo)儀、培養(yǎng)箱(風(fēng)途實(shí)力生產(chǎn)廠)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有胎牛血清的培養(yǎng)基,將細(xì)胞置于其中并在二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度,大約每2 d換1次培養(yǎng)液,7～14 d后倒掉舊的培養(yǎng)液,然后倒入胰蛋白酶液后放入恒溫箱中消化,細(xì)胞間隙變大時(shí)終止消化并輕柔地吹打細(xì)胞,然后接種于新的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)好的細(xì)胞將其分為空白對(duì)照組和不同濃度的大蒜素組,大蒜素組分別加入50、75、100 mg/L的大蒜素。各組分別設(shè)6個(gè)復(fù)孔。

1.3MTT測(cè)定細(xì)胞增殖能力 將細(xì)胞接種于孔板上,置孔板于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h后,丟棄上清,藥物組中每個(gè)孔加入200 μl DMEM稀釋的不同濃度的藥物培養(yǎng)12 h、24 h、48 h,空白對(duì)照組只加入200 μl的DMEM培養(yǎng),在結(jié)束前4 h每孔加入20 μl MTT 5 g/L,4 h后棄上清液,每個(gè)孔都加入二甲基亞砜(DMSO),測(cè)定吸光值。然后計(jì)算。抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力 收集細(xì)胞,首先采用分10% FBS溶液調(diào)整細(xì)胞濃度,然后采用洗滌液清洗2次,然后加入胰蛋白酶液消化細(xì)胞,在500～1 000 r/min速度下低溫離心5 min,然后加入碘化丙啶(PI)染液在避光條件下進(jìn)行染色,然后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 收集細(xì)胞后首先用馬克筆在孔板背面劃線標(biāo)記,然后消化細(xì)胞,終止消化后進(jìn)行離心,然后接入孔板鋪滿,再用槍頭垂直于孔板劃傷細(xì)胞,保證劃痕寬度一致,再用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞3次,洗去細(xì)胞碎片,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在顯微鏡下分別拍攝0 h及48 h的結(jié)果照片。遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的侵襲 收集細(xì)胞,首先水化基底膜,然后將Transwell小室放入培養(yǎng)板中,吸去剩余培養(yǎng)液,然后消化細(xì)胞,終止消化后再離心丟棄培養(yǎng)液,清洗細(xì)胞后加入細(xì)胞重懸液,然后接種細(xì)胞,避免出現(xiàn)氣泡,再將細(xì)胞放入培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h,固定后加結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色后再次清洗細(xì)胞,在顯微鏡下觀察。

1.7Western印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞,加入裂解液,然后在冰上用刮棒快速將細(xì)胞碎片移入離心管中,在4 ℃下以1 200 r/min的速度進(jìn)行離心,然后采用二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定細(xì)胞總蛋白,再進(jìn)行灌膠,然后加足夠電泳液進(jìn)行上樣,然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,將膜用TBS緩沖液浸濕后搖動(dòng)封閉1 h,加入稀釋好濃度的一抗抗體;室溫下孵育、脫色后,過(guò)夜后同樣方法加入二抗;再次清洗,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),然后浸入顯影液中顯色、最后凝膠成像。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,兩兩之間采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大蒜素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 不同濃度大蒜素對(duì)細(xì)胞增殖均有抑制作用,且隨著時(shí)間和濃度的增長(zhǎng)而明顯增長(zhǎng)(P<0.05),見表1。大蒜素作用于細(xì)胞時(shí),48 h的作用較強(qiáng),因此后續(xù)試驗(yàn)均研究48 h的結(jié)果。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較

2.2大蒜素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組細(xì)胞凋亡率明顯較高,且隨著濃度的增高而明顯增高(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組細(xì)胞凋亡

2.3大蒜素對(duì)細(xì)胞侵襲的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯較低,且隨著濃度的增高而明顯降低(P<0.05),見表1、圖2。

圖2 各細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4大蒜素對(duì)細(xì)胞遷移的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組細(xì)胞遷移能力明顯較弱,且隨著濃度的增高而明顯減弱(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組細(xì)胞遷移檢測(cè)的劃痕實(shí)驗(yàn)(×200)

1～4:空白組、50 mg/L大蒜素組、75 mg/L大蒜素組、100 mg/L大蒜素組圖4 各組細(xì)胞Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)

2.5大蒜素對(duì)細(xì)胞Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)的的影響 與空白組相比,不同濃度大蒜素組Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)明顯較高,且隨著濃度的升高而明顯升高(P<0.05),見表1、圖4。

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì),每年患膀胱癌的患者將近40萬(wàn),而死亡人數(shù)可達(dá)15萬(wàn),近年來(lái),由于診斷水平的完善與提高,發(fā)病率有所降低,但該病的死亡率卻一直不下降〔8,9〕。且該病病因較為復(fù)雜,又因?yàn)樘貏e容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,且早期的癥狀并不明顯,許多患者診斷時(shí)已經(jīng)到了晚期,因此導(dǎo)致治療的效果并不理想〔10〕。目前為止,對(duì)該病的治療手段主要是以手術(shù)結(jié)合化療的綜合方式進(jìn)行,化療藥物是影響治療結(jié)果的關(guān)鍵因素,但是許多化療藥物自身存在許多副作用〔11～13〕。因此,積極尋找更加高效的膀胱癌治療方法,提高膀胱癌患者的治療效果、減少?gòu)?fù)發(fā)、改善患者生活質(zhì)量顯得尤為重要〔14〕。大蒜素又叫大蒜新素,其作用體現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的凋上,可被多水平、多靶點(diǎn)誘導(dǎo),主要作用機(jī)制是直接殺傷、抗氧化、特異性阻斷細(xì)胞周期、調(diào)控癌基因和抑癌基因表達(dá)、調(diào)節(jié)免疫功能、致敏和抗腫瘤藥物耐藥等〔15〕。并且,許多凋亡蛋白與膀胱癌的惡性程度有密切的聯(lián)系,Bax蛋白是凋亡通路中的關(guān)鍵分子,其過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16,17〕。

本研究結(jié)果說(shuō)明,大蒜素可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究提到,大蒜素可以抑制腫瘤生長(zhǎng),誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,并且已在胃癌和結(jié)腸癌中證實(shí)了對(duì)其癌細(xì)胞的殺傷作用〔18〕。本研究證實(shí),大蒜素可以抑制膀胱癌細(xì)胞遷移,并且也對(duì)藥物濃度有一定的依賴性。黃從兵等〔19〕研究指出,大蒜素在處理膀胱癌細(xì)胞時(shí),不同時(shí)間均可以抑制細(xì)胞增殖,并且可以誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。這與本研究結(jié)果有一定的相通之處。

有研究用大蒜素處理人黑色素瘤細(xì)胞和基底細(xì)胞癌細(xì)胞,結(jié)果顯示二烯丙基二硫能產(chǎn)生活性氧,損傷而激活p53〔20〕;同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度,降低線粒體膜電位,使癌細(xì)胞阻滯在G2期或M期,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,認(rèn)為大蒜素與G2期或M期特異性化療藥物長(zhǎng)春新堿聯(lián)合使用,不僅可以顯著提高腫瘤的殺傷效果,而且可以降低化療藥物的毒副作用〔21〕。在陳振宇等〔22〕研究中指出,膀胱癌細(xì)胞系和膀胱癌中均發(fā)現(xiàn)Caspase-6 G49A (E17K)突變。表達(dá)突變型Caspase-6的細(xì)胞系在生長(zhǎng)因子退出的條件下表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)性Caspase-6激活。本研究表明,大蒜素可能是通過(guò)激活Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。