石鑫 陳虎 王威 張敬坡

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科,河北 石家莊 050000)

肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌,較為常見,其癌變起始于肝細(xì)胞,發(fā)病機制復(fù)雜,個體差異較大,預(yù)后極差,容易復(fù)發(fā)〔1〕,HCC的生長與許多癌基因或抑癌基因的異常表達有關(guān),與HCC的生長密切相關(guān)〔2〕。HCC在治療性切除后,易產(chǎn)生早期復(fù)發(fā),WNK2是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因〔3〕,失活可引起腫瘤細(xì)胞的浸潤、生長和轉(zhuǎn)移〔4〕。MicroRNAs(miRNAs)是一種小型非編碼RNA,可通過部分結(jié)合其靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)來內(nèi)源性調(diào)控基因表達,其中miR-222-5p在早期是人間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的潛在調(diào)節(jié)因子,可通過靶向其特定基因抑制細(xì)胞分化〔5〕。而在HCC早期復(fù)發(fā)患者血清中,miR-222-5p表達水平顯著上調(diào)〔6〕。但是,目前miR-222-5p和WNK2在HCC中的相互作用機制尚未見報道,本研究通過敲低或過表達miR-222-5p、WNK2,觀察二者對HCC細(xì)胞增殖、克隆形成數(shù)和成瘤能力的影響及miR-222-5p促進HCC生長的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 HCC組織和癌旁組織及細(xì)胞株:收集2020年9～10月河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院肝膽外科切除的HCC組織及癌旁組織,選取術(shù)前均無放化療及免疫治療史的患者18例,男10例,女8例,年齡40～62歲。永生化正常肝細(xì)胞L02由湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心贈送;3株HCC細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫,分別為Hep3B(目錄號:TCHu106)、HepG2(目錄號:TCHu72)、HuH-7(目錄號:TCHu182)。實驗動物:4～6周齡BALB/c雌性裸鼠,許可證號:SCXK(京)2016-0009,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。主要試劑:含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Giboc公司);二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT)、基質(zhì)膠、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、十二烷基硫酸鈉(SDS)(Sigma公司);雙熒光素酶檢測試劑盒(索萊寶生物科技有限公司);6孔培養(yǎng)板和吉姆薩染液(Corning公司);RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Genecopoeia公司);野生型和突變型WNK2 3′ UTR熒光素酶報告基因載體(WNK2 WT、WNK2 MUT)、pSUPER-si NC(RNA干擾空載體)、pSUPER-si WNK2(RNA干擾WNK2載體)、pcDNA(空載體)、pcDNA-WNK2(WNK2過表達載體)、miR-222-5p、WNK2、U6和GAPDH引物及miR-222-5p NC(miR-222-5p陰性對照)、miR-222-5p模擬物(miR-222-5p mimics)、miR-222-5p抑制物(miR-222-5p inhibitor)均由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建或合成;Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司);WNK2兔多克隆抗體抗和辣根過氧化物綴合的二抗(Abcam公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 使用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,培養(yǎng)L02、Hep3B、HepG2和HuH-7細(xì)胞株,于37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞密度達80%～90%時,對細(xì)胞進行傳代。選取HepG2細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達50%～60%時,對細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染并分組,細(xì)胞轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)24 h后,檢測各項指標(biāo)。分為:miR-222-5p NC組(轉(zhuǎn)染miR-222-5p NC)、miR-222-5p inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-222-5p inhibitor)、miR-222-5p mimics組(轉(zhuǎn)染miR-222-5p mimics)、miR-222-5p NC+pSUPER-si NC組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p NC和pSUPER-si NC)、miR-222-5p NC+pSUPER-si WNK2組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p N和pSUPER-si WNK2)、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si NC組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p inhibitor和pSUPER-si NC)、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si WNK2組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p inhibitor和pSUPER-si WNK2)、miR-222-5p NC+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p NC和pcDNA)、miR-222-5p NC+pcDNA-WNK2組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p NC和pcDNA-WNK2)、miR-222-5p mimics+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p mimics和pcDNA)、miR-222-5p mimics+pcDNA-WNK2組(共轉(zhuǎn)染miR-222-5p mimics和pcDNA-WNK2)。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測miR-222-5p和WNK2 mRNA表達 參照RNA抽提試劑盒說明書提取HCC組織、癌旁組織和不同細(xì)胞株總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,對總RNA逆轉(zhuǎn)錄,得到cDNA,按照RT-qPCR試劑盒說明書配制PCR體系,同時設(shè)置反應(yīng)程序,上機檢測。根據(jù)2-ΔΔCt算法,選取內(nèi)參GAPDH、U6,計算WNK2 mRNA、miR-222-5p表達水平。引物序列(5′-3′)為:miR-222-5p正向GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA GGTATTC,反向GCACTGGATACGACAGGATC;miR-222-5p正向CTCAGTAGCCAGTGTAGATCCT,反向AGGATCTCACTGGCTTACTTCAG;WNK2正向TAGT TTGTTTATTTTGTTTTGG,反向CTAAACCTAACACG CCCACCTAAC;U6正向CTCGCTTCGGCAGCACA,反向AACGCTTCACGAATTTGCGT;GAPDH正向AAATGGTGAAGGTCGGTGTG,反向TGAAGGGGTCG TTGATGG。

1.4生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶驗證miR-222-5p和WNK2的靶向關(guān)系 采用mirtarbase在線網(wǎng)站(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)對miR-222-5p作用的靶基因進行預(yù)測,發(fā)現(xiàn)WNK2為其可能的靶分子。對數(shù)生長期的正常肝細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后分為4組:miR-222-5p mimics+WNK2 WT組、miR-222-5p NC+WNK2 WT組、miR-222-5p mimics+WNK2 MUT組和miR-222-5p NC+WNK2 MUT組,每組設(shè)6個復(fù)孔,根據(jù)組別名稱中所涉及的載體對細(xì)胞進行共轉(zhuǎn)染。檢測熒光素酶活性。

1.5細(xì)胞增殖活性檢測 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,每組設(shè)置6個復(fù)孔,使用MTT試劑(10 μl/孔,孵育4 h)、DMSO試劑(150 μl/孔、震蕩15 min)及酶標(biāo)儀(570 nm處OD值)檢測。OD值越大表明其增殖活性越高。

1.6細(xì)胞克隆形成能力檢測 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,胰蛋白酶消化細(xì)胞,進行平板克隆實驗,細(xì)胞懸液濃度為1×106/L,使用6孔板,每孔接種1 ml后,培養(yǎng)條件為37 ℃、含5% CO2,至形成肉眼可見的克隆后,終止培養(yǎng);然后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,甲醇固定,吉姆薩染液染色,通風(fēng)櫥干燥,顯微鏡下計數(shù)。實驗重復(fù)6次。

1.7細(xì)胞在動物體內(nèi)成瘤能力檢測 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,均使用100 μl PBS重懸2×106個細(xì)胞,并于裸鼠右前肢腋皮下接種,于第20天時,對裸鼠實施安樂死,分離瘤體并稱重。

1.8細(xì)胞中WNK2蛋白表達水平檢測 使用Western印跡法檢測癌旁組織、HCC組織及培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞中WNK2蛋白表達水平:首先提取總蛋白、蛋白定量、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,抗體封閉、WNK2鼠抗(1∶1 000)4 ℃過夜孵育、二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,洗膜,顯色,拍照,分析WNK2蛋白表達(GAPDH為內(nèi)參)。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-222-5p、WNK2 mRNA和蛋白在HCC組織、癌旁組織、正常肝細(xì)胞系及不同肝癌細(xì)胞系中表達 肝癌組織存在明顯且完整的包膜,易剝離,組織較硬;肝癌細(xì)胞密集,大小不均,核大胞質(zhì)少,核仁不明顯,見圖1。與癌旁組織相比,HCC組織中miR-222-5p表達水平顯著升高,WNK2 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05);與L02正常肝細(xì)胞相比,Hep3B、HuH-7、HepG2癌細(xì)胞中miR-222-5p表達水平顯著升高,WNK2 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05),見表1、圖2。其中HepG2癌細(xì)胞中miR-222-5p表達水平最高,所以,后續(xù)將選擇HepG2細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染實驗。

表1 HCC組織和癌旁組織miR-222-5p、WNK2 mRNA和蛋白表達水平比較

圖1 不同組織和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(HE染色,×400)

1～6:癌旁組織、HCC組織、L02正常肝細(xì)胞、Hep3B癌細(xì)胞、HuH-7癌細(xì)胞、HepG2癌細(xì)胞圖2 不同組織和細(xì)胞中WNK2蛋白表達

2.2miR-222-5p對各組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)、瘤體重量、體積及WNK2蛋白表達水平的影響 與HepG2癌細(xì)胞組相比,miR-222-5p NC組miR-222-5p表達水平、細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)、瘤體重量體積及WNK2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與HepG2癌細(xì)胞組、miR-222-5p NC組比較,miR-222-5p mimics組細(xì)胞miR-222-5p表達水平、細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著升高,WNK2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);miR-222-5p inhibitor組細(xì)胞miR-222-5p表達水平、細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著降低,WNK2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表2、圖4。

表2 干預(yù)miR-222-5p對各組細(xì)胞增殖、克隆形成數(shù)、成瘤能力及WNK2蛋白表達的影響

圖3 干預(yù)miR-222-5p對克隆形成能力的影響(吉姆薩染色,×20)

1～4:HepG2癌細(xì)胞組、miR-222-5p NC組、miR-222-5p mimics組、miR-222-5p inhibitor組圖4 干預(yù)miR-222-5p對WNK2蛋白表達的影響

2.3miR-222-5p和WNK2基因靶向關(guān)系的預(yù)測與驗證 miR-222-5p與WNK2 3′UTR有靶向結(jié)合位點。見圖5。與miR-222-5p NC+WNK2 WT組(1.13±0.14)相比,miR-222-5p mimics+WNK2 WT組熒光素酶活性(0.54±0.06)顯著降低(t=9.488,P=0.000),而miR-222-5p mimics+WNK2 MUT組和miR-222-5p NC+WNK2 MUT組熒光素酶活性(1.10±0.12、1.08±0.11)無明顯變化(t=0.301,P=0.770)。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測miR-222-5p與WNK2 3′ UTR結(jié)合位點

2.4抑制miR-222-5p和干擾WNK2對癌細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和成瘤能力的影響 與miR-222-5p NC+pSUPER-si NC組相比,miR-222-5p NC+pSUPER-si WNK2組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著升高(P<0.05);miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si NC組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量顯著降低(P<0.05)。與miR-222-5p NC+pSUPER-si WNK2組相比,miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si WNK2組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著降低(P<0.05)。與miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si NC組相比,miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si WNK2組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著升高(P<0.05)。見圖6、表3。

表3 抑制miR-222-5p和干擾WNK2對癌細(xì)胞增殖、克隆形成數(shù)和成瘤能力的影響

圖6 抑制miR-222-5p和干擾WNK2對癌細(xì)胞克隆形成能力的影響(吉姆薩染色,×20)

2.5上調(diào)miR-222-5p和過表達WNK2對癌細(xì)胞增殖、克隆形成數(shù)和成瘤能力的影響 與miR-222-5p NC+pcDNA組相比,miR-222-5p NC+pcDNA WNK2組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著降低(P<0.05);miR-222-5p mimics+pcDNA組增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著升高(P<0.05)。與miR-222-5p NC+pcDNA WNK2組相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著升高(P<0.05)。與miR-222-5p mimics+pcDNA組相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2組細(xì)胞增殖活性、克隆形成數(shù)和瘤體重量、體積顯著降低(P<0.05)。見圖7、表4。

表4 上調(diào)miR-222-5p和過表達WNK2對癌細(xì)胞增殖、克隆形成數(shù)和成瘤能力的影響

圖7 抑制miR-222-5p和干擾WNK2對癌細(xì)胞克隆形成能力的影響(吉姆薩染色,×20)

3 討 論

HCC是世界范圍內(nèi)的一種嚴(yán)重癌癥,其發(fā)病率呈上升趨勢,與晚期肝癌密切相關(guān)〔7〕。HCC主要發(fā)生在慢性肝病背景下,包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染,酒精性肝損傷、脂肪肝疾病或暴露于黃曲霉素等有毒因素引起的慢性病毒性肝炎〔8〕。其復(fù)發(fā)率較高,長期生存率較低〔9〕,且早期臨床表現(xiàn)不明顯,一旦出現(xiàn)癥狀,多已進入晚期,而生物標(biāo)志物可有助于肝癌的早期診斷和治療〔10〕,因此探討HCC相關(guān)分子機制,尋找新的分子標(biāo)志物,對于肝癌的治療具有重要意義。

miRNAs在人類疾病的靶向治療中有廣闊的應(yīng)用前景,其與炎癥信號通路、免疫反應(yīng)、細(xì)胞生理等生物過程密切相關(guān)〔11〕。其中,上調(diào)表達的miR-222-3p可通過抑制其靶基因SOCS5增強宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力〔12〕。劉志春等〔13〕研究發(fā)現(xiàn),miR-222在肝癌組織中表達明顯上調(diào);Xu等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),miR-222-5p水平在肝癌早期顯著升高。本研究提示,miR-222-5p在HCC中高表達,WNK2在HCC中低表達,與Xu等〔14〕研究結(jié)果具有一致性。而miR-222-5p可通過靶向調(diào)節(jié)SFRP4基因促進根尖乳頭干細(xì)胞成骨/成牙本質(zhì)向分化〔15〕,miR-222可通過靶向上調(diào)BBC-3基因表達降低肝癌細(xì)胞的增殖能力,從而促進癌細(xì)胞的凋亡〔16〕。本研究結(jié)果提示,miR-222-5p調(diào)控HCC的生長,但其作用機制尚需進一步研究。

本研究預(yù)測顯示,miR-222-5p序列上存在與WNK2 3′UTR結(jié)合的連續(xù)位點,且經(jīng)雙熒光素酶實驗驗證發(fā)現(xiàn),miR-222-5p和WNK2存在靶向關(guān)系。WNK2是近年來新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因,下調(diào)WNK2可促進結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展〔17〕。且WNK2與患HCC的風(fēng)險增加有關(guān),是HCC易感性的生物標(biāo)志物〔18〕。Du等〔19〕研究發(fā)現(xiàn),提高WNK2表達水平,可抑制胃癌細(xì)胞生長,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Wu等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)抑制WNK2表達,可進一步抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和衰老。本研究結(jié)果提示,干擾WNK2可逆轉(zhuǎn)miR-222-5p inhibitor抑制癌細(xì)胞生長的作用,過表達WNK2可逆轉(zhuǎn)miR-222-5p mimics促進癌細(xì)胞生長作用。推測miR-222-5p對HepG2癌細(xì)胞生長的促進作用可能是通過靶向抑制WNK2表達實現(xiàn)。

綜上,在HCC中,miR-222-5p可能通過負(fù)向調(diào)控抑癌基因WNK2的表達,促進HCC細(xì)胞HepG2增殖、提高克隆形成數(shù)和動物體內(nèi)成瘤能力,進而促進HCC生長,miR-222-5p可通過靶向抑制WNK2,促進HCC生長的新作用機制,有望為HCC的臨床研究提供潛在可行的分子靶點。