汪海波 王廣偉 朱彥澤 李葉 陳星光

(1石家莊市中醫(yī)院,河北 石家莊 050031;2河北省醫(yī)用藥品器械集中采購中心)

肺炎是臨床呼吸科治療中常見的肺部疾病之一。目前西醫(yī)對(duì)于肺炎的治療主要以糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑等進(jìn)行干預(yù)治療〔1〕。研究發(fā)現(xiàn),肺炎的發(fā)生是與自身免疫系統(tǒng)遭到破壞有關(guān),在肺炎治療中進(jìn)行免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)和改善從而控制疾病和減少肺炎的發(fā)病次數(shù),成為現(xiàn)階段疾病治療的重點(diǎn),同時(shí)也是提高患者機(jī)體抵抗力和肺炎治療的根本環(huán)節(jié)〔2,3〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路是一種多向性轉(zhuǎn)錄因子,存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞等多類型細(xì)胞核中,在參與調(diào)控多種細(xì)胞核基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的作用〔4〕。近年來,中醫(yī)藥在肺炎的防治中同樣優(yōu)勢(shì)明顯且療效顯著。桑通顆粒是根據(jù)中醫(yī)理論和多年臨床觀察,經(jīng)現(xiàn)代技術(shù)工藝研制而成的中藥制劑。該方以桑白皮、炒杏仁、川貝、炙麻黃、葶藶子、炒蘇子、清半夏、黃芩、桃仁、前胡等成分組成,具有清肺化痰、止咳平喘、活血行滯等功效,臨床上可用于治療慢性支氣管炎、慢性阻塞性疾病等〔5〕。本文主要通過探究桑通顆粒對(duì)肺炎大鼠免疫調(diào)節(jié)、NF-κB表達(dá)水平的影響及肺組織的保護(hù)作用,為臨床桑通顆粒治療相關(guān)疾病提供理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)大鼠 雄性SPF級(jí)SD大鼠60只,體質(zhì)量150～220 g,購于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物學(xué)部,許可證號(hào):SCXK(湘)2020-0024。所有大鼠在南方醫(yī)院肺病中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度20～25 ℃,相對(duì)濕度40%～60%,該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2藥物、試劑與儀器 桑通顆粒(石家莊市中醫(yī)院),鹽酸左氧氟沙星注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司),肺炎鏈球菌(天津臨床檢驗(yàn)中心),無水乙醇(上海羅輔醫(yī)藥科技有限公司),NF-κB、磷酸化NF-κB抑制因子蛋白(p-IKBα)、p65抗體(美國Santa Cruz公司),山羊抗鼠IgG二抗(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司),RIPA裂解液(美國Sigma公司),電泳儀、電泳槽(美國Sigma公司),Western印跡轉(zhuǎn)膜儀(美國BioRad公司),流式細(xì)胞儀(杭州艾森生物有限公司),離心機(jī)(上海金鵬分析儀器有限公司),顯微鏡、切片機(jī)(上海儀景通光學(xué)科技有限公司),一次性無菌注射器(北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司),戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司),高速冷凍離心機(jī)(江蘇正大天晴公司)。

1.3模型建立 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉,麻醉后固定,進(jìn)行頸部備皮消毒,切開頸部皮膚,暴露上段氣管,用24G的Y型靜脈留置針經(jīng)氣管插管,拔出針芯,使導(dǎo)管完全進(jìn)入氣管,由留置針白色帽端處注入,注入含菌量為400個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏募?xì)菌混懸液0.35 ml,將固定大鼠的手術(shù)臺(tái)豎立起來后緩慢注射,每注射0.1 ml后豎立大鼠,左右旋轉(zhuǎn)大鼠固定臺(tái)1 min后再繼續(xù),接種完成后繼續(xù)豎立大鼠于固定臺(tái)上,使大鼠先后分別保持直立位和倒立位各約2 min,盡量使菌液均勻分布于雙肺各個(gè)肺葉,縫合傷口,局部消毒,所有操作在無菌操作下進(jìn)行。建模后大鼠表現(xiàn)為呼吸急促、乏力氣短、咳嗽等癥狀為建模成功。

1.4分組與給藥 將大鼠分正常(A)組、模型(B)組、桑通顆粒低濃度(C)組、桑通顆粒中濃度(D)組、桑通顆粒高濃度(E)組、西藥(F)組,10只/組。建模后,A、B組采用每日0.2 ml/10 g生理鹽水灌胃,C、D、E組每日分別灌胃5、10、20 g/kg桑通顆粒,F組給予20 mg/kg每日1次左氧氟沙星灌胃,均連續(xù)干預(yù)30 d。

1.5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α 抽取大鼠尾部靜脈血3 ml,3 000 r/min離心10 min,留取上清液,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格參考試劑盒說明書。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+、CD8+表達(dá) 取培養(yǎng)后全血50 μl,分別加入10 μl CD4+、CD8+抗體,于4 ℃避光孵育30 min,加氯化銨(NH4Cl)溶血?jiǎng)? ml,1 000 r/min離心15 min,棄上清,按試劑盒說明書方法采用膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)結(jié)合液及 AnnexinV-FIRC處理細(xì)胞,室溫下避光孵育15 min,再加入碘化丙啶染色液,避光冰浴10 min,流式儀上機(jī) CD4+、CD8+表達(dá)。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色 將大鼠麻醉后經(jīng)斷頭法處死,后切開大鼠腹部,在肺部最大葉距邊緣5 mm處取直徑5 mm、厚1 mm肺組織,多聚甲醛固定,石蠟包埋,4 μm切片,染色并觀察。

1.8Western印跡檢測(cè)NF-κB、p-IKBα、p65蛋白表達(dá) 取肺組織RIPA裂解液提取總蛋白二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度、凝膠電泳后轉(zhuǎn)移聚偏氟乙烯(PVDF)膜、封閉過夜,加兔多克隆抗體NF-κB(1∶500)、p-IKBα(1∶500)、p65(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)孵育后,洗滌,室溫孵育,洗滌后浸入電化學(xué)發(fā)光(ECL)工作液,X線片曝光、顯影后獲取圖像。

1.9聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA表達(dá) 取肺組織0.2 g勻漿研磨后提取總RNA,依據(jù)試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄PCR,反應(yīng)體系20 μl,反應(yīng)條件:80 ℃變性5 min,60 ℃退火5 min,70 ℃延伸15 min,共35個(gè)循環(huán),根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)表達(dá)。引物序列:NF-κB正向:5′-GCAGAGGATTACGAGCAGAT-3′,反向:5′-CCTGGTAGGTTACTC TGTTG-3′;p-IKBα正向:5′-TCCAGGATGTTTCGAGCAATC-3′,反向:5′-TCCAATGGAAGCAGCGGCATC-3′;p65正向:5′-AGGATGCAGTACAGATGAGC-3′,反向:5′-AGGTTACCTGGTCTTGTCTG-3′;β-actin正向:5′-AAACCTCTTAACGATCCATG-3′,反向:5′-CACAA TGCTTGAAGGAGATGG-3′。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá) 與A組比較,B組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α顯著升高(P<0.05);與B組比較,D組以上血清指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與D組比較,E組以上血清指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與E組比較,F組以上血清指標(biāo)顯著升高(P<0.05);B組與C組、D組與F組以上血清指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及外周血中CD4+、CD8+表達(dá)

2.2各組外周血中CD4+、CD8+表達(dá) 與A組比較,B組外周血中CD4+表達(dá)顯著降低、CD8+表達(dá)顯著升高(P<0.05);與B組比較,D組外周血中CD4+表達(dá)顯著升高、CD8+表達(dá)顯著降低(P<0.05);與D組比較,E組外周血中CD4+表達(dá)顯著升高、CD8+表達(dá)顯著降低(P<0.05);與E組比較,F組外周血中CD4+表達(dá)顯著降低、CD8+表達(dá)顯著升高(P<0.05),其中B組與C組,D組與F組以上指標(biāo)比較無顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組CD4+、CD8+表達(dá)

2.3HE 染色 A組肺組織結(jié)構(gòu)完好且無損傷現(xiàn)象;B組及C組間質(zhì)水腫、充血,炎癥細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞間質(zhì)嚴(yán)重;D組及F組肺腔內(nèi)伴隨少量炎性分泌物,支氣管壁平滑肌與上皮細(xì)胞伴隨增生現(xiàn)象;E組腔內(nèi)分泌物明顯減少,水腫現(xiàn)象改善,管壁平滑肌及上皮細(xì)胞增生改善,管周及肺泡壁有極少炎性細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖2 各組肺組織(HE 染色,×200)

2.4各組肺組織中NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA及蛋白表達(dá)比較 與A組比較,B組NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA及蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與B組比較,D組以上指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與D組比較,E組以上指標(biāo)顯著降低(P<0.05);與E組比較,F組以上指標(biāo)顯著升高(P<0.05);B組與C組,D組與F組以上指標(biāo)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2、圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)各組NF-κB、p-IκBα、p65 蛋白表達(dá)

表2 各組肺組織中NF-κB、p-IKBα、p65 mRNA及蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來隨著工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染顯著,致使全球肺炎的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),現(xiàn)階段對(duì)于肺炎的控制已成為全世界廣泛關(guān)注的問題〔6〕。因此,研究肺炎的流行病學(xué)特征及相關(guān)治療因素對(duì)提高肺炎的預(yù)防與治療具有重要意義。免疫學(xué)研究表示,肺炎患者的白細(xì)胞、血小板等免疫細(xì)胞均會(huì)出現(xiàn)不同程度的降低,且免疫缺陷與炎性細(xì)胞的發(fā)展及治療存在密切聯(lián)系〔7〕。而具有清熱祛痰、鎮(zhèn)咳平喘功效的桑通顆粒可廣泛應(yīng)用于急、慢性肺內(nèi)感染等疾病中〔8〕。有研究發(fā)現(xiàn),桑通顆粒對(duì)肺損傷疾病的治療具有一定療效〔9〕。

肺疾病發(fā)生時(shí)由于免疫機(jī)制遭到破壞,體內(nèi)炎性因子的表達(dá)也相繼產(chǎn)生異常,其中,IL-1β、IL-6、TNF-α等作為炎癥細(xì)胞因子可有效參與細(xì)胞免疫過程,在肺炎的免疫病理過程中具有重要作用〔10〕。本研究結(jié)果表明,桑通顆粒可能對(duì)降低肺炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)具有一定效果。相關(guān)研究表示,肺炎發(fā)生時(shí),機(jī)體內(nèi)相關(guān)炎性因子的表達(dá)升高可促進(jìn)炎性細(xì)胞發(fā)生活化,炎性因子可加快炎癥細(xì)胞募集,使炎癥細(xì)胞的吞噬作用增強(qiáng),導(dǎo)致黏膜血管通透性增加,滲出、水腫產(chǎn)生,進(jìn)而加重肺組織炎癥反應(yīng)〔11〕。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),桑通顆粒中桑白皮、黃芩等成分可發(fā)揮消炎、解毒、抑菌及降解細(xì)菌內(nèi)毒素等作用〔12〕。桑通顆?？赏ㄟ^抑制炎癥在肺組織的遞呈功能,直接殺傷病原體或被感染的細(xì)胞,通過分泌γ-干擾素(IFN-γ)調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞,降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的合成和分泌,有效改善大鼠肺部微環(huán)境和肺部病理。

肺組織是機(jī)體合成免疫效應(yīng)分子的主要部位之一,且免疫合成的過程與外周血CD4+、CD8+密切相關(guān)〔13〕。本研究結(jié)果表明,桑通顆?？赏ㄟ^改善肺炎大鼠外周血CD4+、CD8+表達(dá)而提高免疫功能。相關(guān)研究表示,肺炎發(fā)生時(shí)可使外周血CD4+被抑制和CD8+被激活,活化的CD8+發(fā)生核易位,可直接激活目的基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮促炎作用〔14〕。王靖〔15〕在益氣解表方治療小兒乙型流感的療效觀察及預(yù)后分析中表示,方中前胡對(duì)于收縮的支氣管平滑肌有舒張作用,而杏仁成分具有鎮(zhèn)咳及抗菌、抗病毒等功效。由此本文推測(cè),桑通顆粒可能通過前胡、杏仁等多種中藥成分識(shí)別不同特異性抗原受體表位而使B淋巴細(xì)胞激活,參與機(jī)體的非特異性免疫,使其誘導(dǎo)的壞死因子形成功能下降,并通過刺激免疫造血功能,進(jìn)而發(fā)揮抑制機(jī)體特異性免疫和增強(qiáng)機(jī)體固有免疫、體液抗菌的作用。

NF-κB在肺炎中對(duì)細(xì)胞核轉(zhuǎn)移及炎癥基因啟動(dòng)具有重要意義〔16〕。本研究結(jié)果表明,桑通顆?？赡軐?duì)抑制肺炎大鼠肺組織中NF-κB、p-IKBα、p65表達(dá)具有積極作用。相關(guān)研究表示,肺炎發(fā)生時(shí)NF-κB通過促進(jìn)趨化因子使凋亡執(zhí)行蛋白激活并抑制抗炎癥免疫,使其無法發(fā)揮抗炎作用,進(jìn)而引起肺組織細(xì)胞內(nèi)損傷并加速肺炎疾病的進(jìn)程〔17〕。桑通顆粒中的桃仁具有抗炎、解熱、平喘祛瘀等功效,而半夏則具有降低呼吸中樞興奮、抑制咳嗽反射等作用〔18,19〕。本文推測(cè),肺炎中桑通顆粒可能通過多種成分相互作用起到抑制細(xì)胞分泌炎性因子,阻斷肺部特異位點(diǎn)上的酪氨酸,并通過抑制下游激酶的活化效應(yīng),降低NF-κB、p-IKBα、p65在肺中的遞呈功能,抑制炎性因子的合成和分泌,進(jìn)而起到降低肺部炎性反應(yīng)和降低肺炎造成的肺損傷的作用。

綜上所述,桑通顆粒對(duì)降低肺炎大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α,增加CD8+、降低CD4+及抑制NF-κB、p-IKBα、p65表達(dá)等方面具有一定作用,但現(xiàn)階段對(duì)于桑通顆粒是通過何種方式影響調(diào)控肺炎疾病進(jìn)展及在肺炎治療中的具體機(jī)制仍需探究。