王璐鵬 張雅 張欣 耿思源

(河北省中醫(yī)院,河北 石家莊 050001)

下肢動脈硬化閉塞癥是指下肢動脈粥樣斑塊形成阻塞血管后,引起下肢供血不足的一種疾病,是最為常見的外周動脈疾病,其通常表現(xiàn)為患肢皮膚溫度降度、疼痛及間歇性跛行等情況,嚴重時則會導致組織潰瘍、壞死,這對患者的生產(chǎn)生活造成了極大的影響,因此探尋一種有效的治療手段尤為重要〔1〕。該病的致病因素較為復雜,目前關于其發(fā)病機制的研究多側重于內(nèi)膜損傷、氧化應激及炎癥反應,其中血管內(nèi)皮細胞作為心血管系統(tǒng)的屏障和重要組成部分近年來已被證實其功能紊亂是內(nèi)膜損傷動脈粥樣硬化的始動因素〔2〕。有研究表明,氧化應激是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制之一,其產(chǎn)生的過量氧自由基能夠損傷血管內(nèi)皮,從而使光滑的血管壁受到破壞,最終導致斑塊的形成,因此如何抑制氧化應激是目前臨床研究的焦點〔3〕。動脈粥樣硬化的發(fā)生是一個慢性炎癥過程,下肢動脈硬化閉塞癥同樣如此,而S100B是近年來發(fā)現(xiàn)的具有促炎性介質(zhì)細胞因子樣作用的鈣結合蛋白,研究表明其可以引起免疫炎癥反應,從而參與體內(nèi)許多重要的病理反應,故可推測其可能在下肢動脈硬化閉塞癥的發(fā)病機制中起著重要作用〔4〕。目前臨床治療該病的主要手段為手術治療,但其具有一定風險且費用較高,而中醫(yī)作為我國傳統(tǒng)醫(yī)學則沒有這方面的憂慮,且經(jīng)過多年臨床研究已經(jīng)取得了顯著的療效并積累了豐富的經(jīng)驗〔5〕。人參黃芩配伍不僅體現(xiàn)了中藥組方原則與辨證論治的結合,還共湊調(diào)燮寒熱、益氣解毒、活血化瘀之功效,同時還有抗炎、抗氧化等作用〔6〕。但其在下肢動脈硬化閉塞癥中尚無研究,本文探討人參黃芩配伍通過調(diào)控S100B信號通路對下肢動脈硬化閉塞癥大鼠內(nèi)皮細胞功能、氧化應激的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取遼寧長生生物技術股份有限公司提供的80只SPF級SD雄性大鼠(合格證書為:SCXK(遼)2019-00044),體質(zhì)量200～250 g,大鼠單籠喂養(yǎng),室溫生長,模仿12 h晝夜交替,在常溫下進行無菌自由進食、飲水2 w,按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。本次實驗經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.2實驗材料 人參黃芩配伍(由醫(yī)院自制,配伍比例為等比配伍);曲美他嗪(貨號:BP12019,北京康瑞納有限公司);低溫冷凍離心機(型號:Medifriger-BL-S,北京金恒祥有限公司);蘇木素染液(貨號:H9627,美國Sigma公司);伊紅染液(貨號:AG1100～100 ml,上海吉至有限公司);光學顯微鏡(型號:CX-60,日本OLYMPUS公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:IC-SOD-Hu,上海鈺博有限公司);多功能酶標儀(型號:Spark,北京賽百奧有限公司);超氧化物酶化酶(SOD)試劑盒(貨號:042-02801,廣州威佳有限公司);丙二醛(MDA)試劑盒(貨號:YT-C-A333,上海韻泰有限公司);Pentamidine(貨號:HY-B0537B,美國Med Chem Express LLC公司);NP-40緩沖裂解液(貨號:amresco,上海嶸崴達有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號:E112-01,南京諾唯贊有限公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(貨號:KGP113,凱基有限公司);S100B抗體(貨號:FNab07566,武漢菲恩有限公司);細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)抗體(貨號:EY-K4241,上海一研有限公司);核因子(NF)-κB抗體(貨號:YS-7497R,上海雅吉有限公司);GAPDH抗體(貨號:FNab03343,武漢菲恩有限公司);電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(貨號:CDLG-4911,武漢純度有限公司)。

1.3建模 選取40只SPF級SD雄性大鼠,給予高脂飼料喂養(yǎng)1 w后進行下肢動脈硬化閉塞癥建模,首先將大鼠固定,然后腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉,剃除左下肢股內(nèi)毛發(fā),消毒后,從腹股溝中點處縱向開口2 cm并游離出隱動脈,用動脈夾夾住動脈兩端,然后沿動脈長軸將胰島素注射器從遠端向近端刺入管腔,緩慢注入0.3 ml注射用無菌蒸餾水,維持5 min后取下動脈夾,壓迫止血并縫合,給予腹腔注射20萬U的青霉素后放回籠內(nèi),繼續(xù)給予高脂飼料飼養(yǎng)4 w,當肢體出現(xiàn)缺血性改變、壞死時則視為建模成功,4 w后,發(fā)現(xiàn)因大鼠自身體制免疫力低下等因素,共有5只大鼠死亡,余下大鼠均造模成功。

1.4分組及給藥 從建模成功的大鼠中隨機選取30只,將其分為模型(M)組,曲美他嗪(T)組,人參黃芩配伍(G)組,每組10只,同時隨機選取10只正常大鼠作為正常對照(N)組,對T組灌胃30 mg/kg曲美他嗪,對G組灌胃2 g/kg人參黃芩,兩組均1次/d,持續(xù)30 d,N組、M組同期給予灌胃同體積生理鹽水。

1.5缺血肢體塔洛夫(Tarlov)評分 對各組大鼠在治療后由觀察員單盲觀測然后認真記錄,然后進行Tarlovi評分,評分標準為:總分0～6分,0分為后肢無運動、不能負重,1分為后肢可見活動,但不能負重;2分為后肢活動頻繁或有力,不能負重,3分為后肢可支持體重,可行走1～2步;4分為可行走,輕度跛行;5分為正常行走,速度慢;6分為可正?？焖傩凶?。

1.6標本采集 實驗完成后,腹腔注射400 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,行腹主動脈取血,靜置10 min后,在4 ℃、3 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液在零下80 ℃條件下密封保存,同時分離出大鼠左下肢股動脈,4%多聚甲醛溶液中固定72 h,進行常規(guī)石蠟包埋、切片處理后放入冰箱密封保存。

1.7大鼠病理組織HE染色 取各組血管組織,二甲苯及梯度乙醇脫蠟后,用蘇木素浸染5 min,蒸餾水洗滌后,1%鹽酸乙醇溶液進行分色20 s,蒸餾水洗滌,伊紅染液,染色1 min,蒸餾水洗滌后,進行梯度乙醇及二甲苯脫水、透明、中性樹膠封片處理,用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.8ELISA檢測血清中內(nèi)皮細胞功能相關指標 取各組血清,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,嚴格按照試劑盒說明書檢測內(nèi)皮素(ET)-1、一氧化氮(NO)、肝細胞生長因子(HGF)含量,首先進行繪制樣本布局表、配制試劑標準品、清洗孔板,然后在對應孔板中加入100 μl標準品工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育90 min后,加100 μl生物素化抗體工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育60 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后向每孔加100 μl辣根過氧化物酶(HRP)結合物工作液,37 ℃恒溫孵箱孵育30 min,PBS洗滌3次后向每孔加入90 μl底物溶液,37 ℃恒溫孵箱孵育15 min后,每孔加入50 μl終止液終止反應,實驗完成后立即用酶標儀在450 nm相對630 nm波長處,測定每孔吸光度,繪制標準曲線,然后通過標準曲線,計算ET-1、NO、HGF含量。

1.9各組氧化應激相關指標檢測 黃嘌呤氧化酶法檢測大鼠血清中SOD水平。取各組血清,嚴格按照其實驗步驟進行實驗,首先按照試劑說明書配制好試劑,然后用均勻器進行混勻,37 ℃水浴40 min后,在波長550 nm處進行蒸餾水凋零,實驗完成后立即用酶標儀測定每孔光密度(OD)值,繪制標準曲線,然后通過標準曲線,計算SOD含量=(對照OD值-測定OD值)÷對照OD值÷50%×反應體系的稀釋倍數(shù)×檢測樣本前的稀釋倍數(shù)。硫代巴比妥酸法檢測大鼠血清中MDA水平。取各組血清,嚴格按照其實驗步驟進行實驗,首先按照試劑說明書配制好試劑,然后用均勻器進行混勻,100 ℃水浴40 min后冷卻,然后在3 000 r/min的條件下離心10 min,取上清液,用酶標儀在523 nm處測定每孔OD值,繪制標準曲線,然后通過標準曲線,計算MDA含量=〔(對照OD值-空白OD值)÷標準照OD值-空白OD值〕×標準品濃度(10 nmol/ml)×檢測樣本前的稀釋倍數(shù)。

1.10Western印跡檢測血管組織S100B信號通路相關蛋白表達 取剩余30只大鼠,建模后從未死亡的大鼠中隨機選取20只,分為兩組,每組10只,一組給予灌胃5 mg/kg S100B抑制劑Pentamidine,記為P組,一組給予Pentamidine聯(lián)合人參黃芩配伍,記為O組,然后取各組血管組織清洗、剪碎,PBS洗滌3次后,加入1 ml預冷NP-40緩沖裂解液并研磨成勻漿,然后在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心15 min,取上清液用BCA法測定S100B、ERK、NF-κB蛋白表達,首先按照試劑盒說明書配制好工作液,然后取等濃度的上清液加入等體積的加樣緩沖液,沸水浴3 min,冷卻后進行SDS-PAGE,電泳電壓為60 V,4 h后用半干法將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,轉(zhuǎn)膜條件為80 V 120 min,轉(zhuǎn)膜1.5 h,洗滌后5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜,加入稀釋的S100B(1∶1 000)、ERK(1∶1 000)、NF-κB一抗(1∶1 000),4 ℃搖床振蕩孵育過夜,PBS洗滌3次,加入稀釋的辣根酶標記的二抗(1∶5 000),37 ℃輕搖室溫孵育2 h;PBS洗滌3次,用ECL熒光試劑盒測定結果,拍照并進行蛋白條帶灰度值分析,然后計算與GAPDH比值求得S100B、ERK、NF-κB蛋白相對表達含量。

1.11統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組Tarlov評分 與N組比較,M組Tarlov評分明顯降低(P<0.05);與M組比較,T、G兩組Tarlov評分均明顯升高(P<0.05),且與T組相比,G組顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組Tarlov評分、血清中內(nèi)皮細胞功能相關指標及SOD、MDA含量比較

2.2各組血清中內(nèi)皮細胞功能相關指標 與N組比較,M組血清中ET-1、HGF顯著升高,NO顯著降低(P<0.05);與M組比較,T、G兩組血清中ET-1、HGF明顯降低,NO顯著升高,且G組與T組相比差異顯著(P<0.05),見表1。

2.3各組血清中氧化應激相關指標 與N組比較,M組血清中SOD含量顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.05);與M組比較,T、G兩組SOD含量顯著升高,MDA含量顯著降低,且G組比T組變化顯著(P<0.05),見表1。

2.4各組血管組織HE染色 N組血管結構清晰完整,血管內(nèi)皮細胞無增生及脫落,未見動脈硬化斑塊及炎性細胞浸潤,而M組動脈壁各層分界不清,血管壁明顯變厚,平滑肌細胞排列紊亂,可見大量內(nèi)皮細胞增生、脫落及炎性細胞浸潤,且出現(xiàn)明顯動脈硬化斑塊;與M組相比,T、G 兩組血管形態(tài)有所改善,動脈硬化斑塊明顯減少,且G組比T組改善明顯,見圖1。

圖1 各組血管組織結構(HE染色,×200)

2.5各組血管組織中S100B信號通路相關蛋白表達 與N組比較,M組血管組織中S100B、ERK、NF-κB的蛋白表達明顯升高(P<0.05);與M組比較,T、G兩組血管組織中S100B、ERK、NF-κB蛋白表達均明顯降低,且G組比T組降低顯著(P<0.05);而P組與G組相比無明顯差異(P>0.05),O組較P組降低明顯(P<0.05),見表2、圖2。

圖2 各組血管組織中S100B、ERK、NF-κB蛋白表達

表2 各組血管組織中S100B信號通路相關蛋白表達

3 討 論

下肢動脈硬化閉塞癥多發(fā)于70歲以上男性,其作為一種全身性動脈硬化疾病的局部表現(xiàn),具有治療難度大、預后差、發(fā)病率及死亡率高的特點,這導致該病已成為世界范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病之一〔7〕。因此,探尋一種有效的治療手段對緩解患者病痛,提高生存率及生活質(zhì)量具有深遠意義〔8〕。有研究發(fā)現(xiàn),中藥治療下肢動脈硬化閉塞癥具有明顯的優(yōu)勢及良好的臨床效果,其可明顯縮短治療進程,并降低致殘率〔9〕。

本研究發(fā)現(xiàn),人參黃芩配伍具有顯著療效。曲美他嗪是一種3-酮?；o酶A抑制藥,其在抑制氧化應激、維持線粒體的正常功能、抗肌肉缺血、保護缺血內(nèi)皮細胞等方面發(fā)揮著重要的作用,已被廣泛應用于臨床外周動脈疾病的治療,因此本文用其作為對照組〔10〕。而人參黃芩配伍早在唐代王燾編纂的《外臺秘要》一書中就有提到,其主治傷寒吐下后,內(nèi)外有熱,煩渴不安,且經(jīng)現(xiàn)代醫(yī)學研究證實,人參與黃芩均具有抗炎、抗氧化的功效,二者配伍可起到協(xié)同增效的作用,故治療下肢動脈硬化閉塞癥當有奇效〔11〕。血管內(nèi)皮細胞是一薄層扁平的上皮細胞,其可形成血管的內(nèi)壁,具有屏障功能、調(diào)節(jié)血管張力、保證血流通暢、調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞等諸多功能,在血管功能的調(diào)節(jié)及穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮了重要作用〔12〕。

有研究表明,血管內(nèi)皮細胞功能障礙可引起局部血小板聚集、血栓形成,最終導致局部甚至全身的動脈粥樣硬化性心血管疾病,下肢動脈硬化閉塞癥就伴有明顯的血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)皮功能障礙,因此如何改善血管內(nèi)皮細胞功能、有效促進血管內(nèi)膜再內(nèi)皮化是臨床研究的重點之一〔13〕。而ET-1是一種縮血管活性物質(zhì),NO是一種舒血管因子,HGF是一種血管內(nèi)皮細胞損傷的保護性因子,其均在血管內(nèi)皮細胞功能中發(fā)揮著重要作用,故三者的水平變化可間接反映血管內(nèi)皮細胞功能〔14〕。對于下肢動脈硬化閉塞癥大鼠,人參黃芩配伍可能是通過調(diào)節(jié)血脂代謝,來降低血液黏稠度,從而抑制血小板聚集和黏附、降低單核細胞活化水平、抑制血管中膜的平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移、表型轉(zhuǎn)換及過度增殖等,進而有效改善血管通透性、降低血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、抑制斑塊形成,最終有效改善血管內(nèi)皮細胞功能,使癥狀得到緩解。初麗敏等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),曲美他嗪聯(lián)合前列地爾可使下肢動脈硬化閉塞癥患者ET-1顯著降低,NO顯著升高,說明其可改善內(nèi)皮細胞功能,這與本文結果類似。

本研究結果說明,人參黃芩配伍可有效改善氧化應激。氧化應激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素,而SOD及MDA是反映氧化應激狀態(tài)的重要指標,其中SOD被視為生命科技中最具神奇魔力的酶,其可阻斷自由基的毒性反應,清除超氧陰離子自由基,最終保護細胞免受損傷,而MDA則是一種脂質(zhì)過氧化物,其在機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷中扮演著重要角色〔16〕。對于下肢動脈硬化閉塞癥,目前普遍認為內(nèi)皮損傷是其發(fā)生的始動因素,而氧化應激可損傷血管內(nèi)皮,從而刺激分泌各種炎癥因子和血管生長因子,進一步引發(fā)血管內(nèi)膜病理性增生,最終導致管腔狹窄甚至閉塞〔17〕。而對于下肢動脈硬化閉塞癥大鼠,人參黃芩配伍可能是通過改善機體內(nèi)循環(huán),來改善細胞膜的流動性及通透性,從而有效清除氧自由基、抑制多種黏附分子基因表達劑細胞膜脂質(zhì)過氧化、抑制血管平滑肌細胞增殖,進而抑制氧化應激水平,減少血小板聚集和血栓形成,最終有效改善疾病癥狀。石曉明等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),下肢動脈硬化閉塞癥患者中SOD含量降低,MDA含量升高,給予治療后SOD含量顯著升高,MDA含量顯著降低,這與本文結果類似。

本研究結果說明,人參黃芩配伍對S100B信號通路具有顯著抑制作用。研究發(fā)現(xiàn),S100B具有促炎效應,其可通過激活其下游靶基因ERK/NF-κB,使其水平持續(xù)升高,釋放細胞因子并促進平滑肌細胞的增殖,同時其還可觸發(fā)氧化應激反應,故S100B信號通路在多種炎性疾病的病理、生理過程中均占有重要地位〔19〕。而炎癥反應是下肢動脈硬化閉塞癥等多種心血管疾病最基本的、重要的病理過程,因此探尋炎癥反應的作用機制一直是臨床學者工作的重點〔20〕。對于下肢動脈硬化閉塞癥大鼠,人參黃芩配伍可能是通過調(diào)控鈣離子信號轉(zhuǎn)導,來抑制S100B的表達,從而抑制其下游相關信號通路的激活、抑制多種蛋白激酶底物的磷酸化、抑制細胞黏附分子、前炎性細胞因子等細胞因子的表達,進而抑制單核巨噬細胞的遷移、抑制促血栓組織因子生成、并降低血管局部炎癥反應,最終改善內(nèi)皮細胞損傷,抑制動脈粥樣硬化的形成。盛樂智等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),非糖尿病人群中血清S100B水平與急性冠狀動脈綜合征相關,其檢測對疾病的早期診斷可能具有積極的臨床意義,這與本文結果類似。

綜上,人參黃芩配伍可顯著改善下肢動脈硬化閉塞癥大鼠內(nèi)皮細胞功能及氧化應激,其機制可能與抑制S100B信號通路有關。