付丹妮 甄東 軒天麒 張瑄 于麗君 劉明潔 王敏,2

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2附屬醫(yī)院)

長(zhǎng)期大量飲用酒精飲料會(huì)嚴(yán)重?fù)p害人體各個(gè)器官和系統(tǒng),包括肝臟、胰腺、心臟、大腦、骨骼、免疫系統(tǒng)和骨骼肌等〔1〕。長(zhǎng)期慢性攝入酒精會(huì)造成多種心肌損傷,包括心肌重塑、心肌肥厚、心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變,蛋白質(zhì)合成減少,纖維性結(jié)構(gòu)受損,心肌收縮功能紊亂,肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,氧化應(yīng)激,運(yùn)輸和脂肪酸代謝紊亂,在晚期最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡應(yīng)激〔2,3〕。蘇格木勒-3湯(SD-3)又名豆蔻三味湯,是內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院自制的蒙藥制劑,由白豆蔻、白苣勝、蓽茇組成,為赫依病之專方(赫依相當(dāng)于中醫(yī)理論中的“氣”),尤對(duì)心赫依病效果更佳。前期研究結(jié)果表明,SD-3對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚及心肌細(xì)胞鈣超載具有一定的保護(hù)作用〔4～7〕。臨床應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn),SD-3與常規(guī)溶栓的西藥聯(lián)合應(yīng)用能夠有效保護(hù)患者的心肌損傷〔8,9〕。本研究探索SD-3對(duì)酒精性心肌病(ACM)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 SD-3經(jīng)蒸餾水沸水浸泡密封過(guò)夜后,4層紗布過(guò)濾除去沉渣得上清液,每毫升上清液中含0.2 g生藥,將其保存在4 ℃冰箱。戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

1.2動(dòng)物模型建立與分組 SD健康SPF級(jí)雄性大鼠60只,體質(zhì)量200～220 g,由長(zhǎng)春億斯公司提供,全部大鼠以普通飼料喂養(yǎng),飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)溫度為20～22 ℃及相對(duì)濕度為50%～60%的清潔、通風(fēng)較好的動(dòng)物室中,分籠飼養(yǎng),8只/籠,籠子足夠大鼠自由活動(dòng),同樣可自由飲水進(jìn)食,平均12 h的自然晝夜條件。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后,稱重后隨機(jī)分為6組(n=10),分別為正常(CON)組、模型(ACM)組、SD-3低劑量(ACM+SL)組、SD-3中劑量(ACM+SM)組、SD-3高劑量(ACM+SH)組、陽(yáng)性藥物曲美他嗪(ACM+TI)組。除了CON組以普通水飲用及灌胃,其余5組第1周以10 %酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃1次,第2周以10%酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃2次,第3～16周,20%酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃2次,第17周至第6個(gè)月以30%酒精隨意飲用,60%酒精每周灌胃2次。在進(jìn)行酒精灌胃的同時(shí),ACM+SL、ACM+SM、ACM+SH組分別用50、100和200 mg/(kg·d)劑量灌胃。

1.3心臟指標(biāo)檢測(cè) SD-3末次給藥后,大鼠禁食不禁水,稱取體質(zhì)量,按45 mg/kg劑量腹腔注射2%戊巴比妥鈉。麻醉后,采用彩色多普勒超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟指標(biāo),觀察記錄各組左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、短軸縮短率(FS)等指標(biāo)。

1.4病理觀察 大鼠麻醉前操作同1.3。麻醉后取心臟,用0.9 %氯化鈉溶液清洗心臟組織及血跡,觀察心臟形態(tài)變化。稱取各組心臟重量,心臟肥厚程度以心臟重量指數(shù)(HW/BW)表示。截取心尖部分,置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson染色,并在顯微鏡下觀察大鼠心肌組織的病理學(xué)改變。

1.5血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 取大鼠新鮮血液,常溫下,3 000 r/min離心15 min,取上清得各組血清。采用相應(yīng)的南京建成肌酸激酶(CK-MB)、肌鈣蛋白(CTn)T、三酰甘油(TG)和總膽固醇(TC)試劑盒,檢測(cè)各組血清中以上指標(biāo)含量,具體步驟操作參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6Western印跡實(shí)驗(yàn) 取新鮮大鼠心臟組織,剪成小塊后超聲粉碎器制備心臟組織勻漿,用一定體積的放射免疫沉淀(RIPA)裂解30 min,4 ℃,12 000 r/min離心10 min取上清,用碧云天定量試劑盒進(jìn)行含量測(cè)定。依次進(jìn)行配膠、加樣并跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、孵二抗、電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。采用ImageJ 軟件(V1.8.0 版)進(jìn)行蛋白條帶定量分析,GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組心臟外觀及HW/BW指數(shù) 與CON組相比,ACM組HW/BW顯著升高(P<0.05);與ACM組相比,ACM+SL、ACM+SM和ACM+SH組呈濃度依賴性降低酒精誘導(dǎo)的HW/BW增加。但ACM與ACM+TI組HW/BW差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示SD-3可以改善酒精誘導(dǎo)的心肌肥厚。見圖1、表1。

表1 各組心功能、HW/BW及膠原含量

圖1 各組心臟大體

2.2各組心臟指標(biāo) 與CON組相比,ACM組LVEDD顯著上升,LVESD、EF和FS顯著下降(P<0.05,P<0.01)。說(shuō)明長(zhǎng)期過(guò)量的酒精攝入能夠?qū)е滦募》屎?使左室收縮功能下降,但經(jīng)不同劑量SD-3處理后上述現(xiàn)象得到改善。與ACM組比較,ACM+TI組LVEDD、LVESD顯著改善(P<0.05),表明TI處理能緩解酒精誘導(dǎo)的大鼠心功能異常。見表1、圖2。

圖2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組心功能

2.3各組心肌組織病理 CON組心肌組織細(xì)胞完整,結(jié)構(gòu)正常,界限清晰。ACM組心肌組織細(xì)胞崩解壞死,細(xì)胞排列紊亂,界限不清,細(xì)胞核散在,呈彌漫性壞死,胞質(zhì)混濁,細(xì)胞核散在于細(xì)胞之間;而經(jīng)不同劑量SD-3處理后有所緩解。Masson染色結(jié)果及膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)定量分析結(jié)果顯示,與CON組相比,ACM組心肌間質(zhì)纖維化明顯增加(P<0.05),而經(jīng)不同劑量SD-3給藥后,心肌間質(zhì)纖維化有不同程度改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ACM+TI組膠原含量較ACM組改善,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組心肌組織(×200)

2.4各組血清中CTnT、CK-MB、TG和TC含量 與CON組相比,ACM組CTnT、CK-MB、TG和TC含量顯著增加(P<0.01);而與ACM組相比,ACM+SL、ACM+SM、ACM+SH組CTnT、CK-MB、TG和TC含量則呈濃度依賴性降低,ACM+TI組cTnT、CK-MB含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清CTnT、CK-MB、TG、TC及Bax、Caspase3、Caspase7和Bcl-2表達(dá)

2.5各組心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白 與CON組比較,ACM組B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶(Caspase)3、Caspase7活性顯著升高,Bcl-2活性顯著降低(P<0.05,P<0.01);與ACM組比較,ACM+SM、ACM+SH和ACM+TI組Bax、Caspase3、Caspase7活性顯著降低,Bcl-2活性顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表2、圖4。

1～6:CON組、ACM組、ACM+SL組、ACM+SM組、ACM+SH組、ACM+TI組圖4 Western印跡檢測(cè)各組Bax、Caspase3、Caspase7和Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

研究表明,長(zhǎng)期過(guò)量飲酒導(dǎo)致的ACM主要以心臟重量增加,左室擴(kuò)張,心功能不全等表現(xiàn)為主〔10〕。過(guò)量的酒精會(huì)引發(fā)多種臟器疾病,尤其是肝臟和心臟。研究表明,體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積過(guò)量的酒精及其代謝物乙醛會(huì)引發(fā)心肌毒性,從而造成ACM〔11〕。ACM的發(fā)展和進(jìn)程伴隨著許多病理和分子變化,在此過(guò)程中心肌細(xì)胞及組織會(huì)產(chǎn)生一系列不良的結(jié)構(gòu)變化,涉及多種機(jī)制,包括氧化應(yīng)激的產(chǎn)生、凋亡性細(xì)胞死亡、線粒體生應(yīng)激受損、脂肪酸及蛋白質(zhì)代謝和運(yùn)輸紊亂等〔12〕。細(xì)胞凋亡是存在于機(jī)體整個(gè)生命進(jìn)程的基本生理機(jī)制,在心肌細(xì)胞中,Bcl-2和Bax相互作用,共同調(diào)控細(xì)胞凋亡〔13,14〕。有證據(jù)表明,在ACM動(dòng)物模型中,長(zhǎng)期大量酒精導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和凋亡,引起細(xì)胞凋亡Bcl-2相關(guān)蛋白和Caspase3活性增加,且促使脂質(zhì)及過(guò)氧化物蓄積,造成心肌肥厚〔15〕。在傳統(tǒng)蒙醫(yī)理論中,將心血管疾病臨床癥狀歸納為心赫依病,心為赫依主串行之道,蒙醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》記載“治心、主脈、大腸之病,應(yīng)以抑赫依為主”。本文前期的研究發(fā)現(xiàn),SD-3作為抑赫依之專方,能夠改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠的心肌肥厚。本研究結(jié)果表明,SD-3通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase3、Caspase7等表達(dá),增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá),保護(hù)心肌細(xì)胞免受酒精的損傷,維持心肌細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定,從而治療ACM。