王堅 謝瑜 陳麗娟

(云南省第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科,云南 昆明 650032)

微炎癥狀態(tài)是一個影響慢性腎衰竭患者預(yù)后的重要獨立危險因素,本文探討慢性腎臟病(CKD)核因子(NF)-κB p65和炎性因子與動脈硬化(AS)的關(guān)系及血液濾過透析(HDF)治療對其影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取云南省第一人民醫(yī)院2017年2月至2019年9月腎功能正常CKD1期患者40例為N組,其中男22例,女18例,平均年齡(60.6±9.3)歲,原發(fā)病分別為:慢性腎小球腎炎27例,系統(tǒng)性紅斑狼瘡9例,糖尿病腎病4例;CKD5D期患者80例,男44例,女36例,平均年齡(62.6±2.3)歲,其原發(fā)病分別為:慢性腎小球腎炎33例,糖尿病腎病20例,系統(tǒng)性紅斑狼瘡7例,多囊腎4例,梗阻性腎病2例,尿酸性腎病2例,其余12例為原發(fā)病不明者。CKD5D期患者均已接受血液透析(HD)治療3個月以上,病情穩(wěn)定,入組后隨機分為在線(OL)HDF組及HD組各40例。

1.2治療方法 HDF組及HD組治療時間均為3次/w,4 h/次,血管通路均為自體內(nèi)瘺,以低分子肝素鈣為抗凝劑,根據(jù)患者的凝血功能調(diào)整劑量,依據(jù)患者不同水負荷情況制定超濾脫水量。兩組透析器均采用Fresenius聚砜膜 F6,血流量250 ml/min,透析液流量500 ml/min,HDF組每次給予稀釋輸入置換液20 L。受試者在觀察期間出現(xiàn)嚴重感染,心腦血管并發(fā)癥;反復(fù)出現(xiàn)急性并發(fā)癥者;試驗過程中改為腹膜透析,接受腎移植者或轉(zhuǎn)其他醫(yī)院治療及強烈要求中止試驗者,均退出觀察。

1.3標本采集和處理 所有患者入組后采集血樣,并于治療3個月后復(fù)查所有指標。血液標本采集于真空試管中,并立即4 ℃離心(美國Beckman J6-HC冷凍離心機),分離血清,置于-20 ℃保存。

1.4主要試劑與儀器 核轉(zhuǎn)錄因子試劑:NF-κB測定試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20180901;單核細胞趨化因子(MCP)-1測定試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20180901;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒:TaKaRa公司,批號:AK5202;SIRT1引物:生工生物工程(上海)股份有限公司;熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒:TaKaRa公司,批號:AHF1428A。儀器:Power Wave XS型全波長酶標儀:Gene Company Limited;Centrifuge AU5831型全自動生化分析儀:美國貝克曼庫爾特有限公司;StepOnePlus熒光定量PCR儀:ABI公司;5810R型離心機:Eppendorf公司。

1.5兩組入組時及不同血液凈化治療3個月后數(shù)據(jù) ①酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清白細胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、MCP-1、核因子(NF)-κB水平。②免疫增強透射比濁法測定超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP);③Western印跡檢測NF-κB蛋白表達,取40 μg 蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5% 的脫脂奶粉封閉2 h,使用抗 NF-κB抗體(1∶1 000,Abcam)進行4 ℃過夜孵育。TBST緩沖液洗滌 3 次,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶2 000,博士德)室溫孵育 1 h,洗滌 3 次后進行電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯影,凝膠成像儀(GelDoc 2000,Bio-Rad)下曝光和拍照,全部試驗均用β-actin作內(nèi)參。所用引物序列(5′-3′):NF-κB上游引物:CATGGTGGTTGGCTTTGCA,下游:AGCCCCTAATACACGCCTCTGT;β-actin上游引物:ACCACCATGTACCCAGGCAT,下游:CCGGACTCATC GTACTCCTG。

1.6兩組入組時及不同血液凈化治療3個月后行頸動脈超聲檢查 HITACHI EUB-550超聲診斷儀,測定兩組頸動脈內(nèi)-中膜厚度(IMT)。受試者任意一側(cè)頸動脈IMT≥1.0 mm或有斑塊形成視為出現(xiàn)動脈AS,反之則視為未發(fā)生AS。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行方差分析中的多重比較q檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組為癥狀態(tài)指標比較 與N組相比,HD組、HDF組治療前血清IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP、MCP-1、NF-κB p65水平均明顯增高(P<0.01);發(fā)生AS比例也明顯增高(P<0.05)。經(jīng)3個月治療后,HD組血清IL-6、IL-8、TNF-α、hs-CRP、MCP-1、NF-κB p65水平較治療前降低,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);HDF組上述指標較治療前明顯改善(P<0.05)。3個月后HD組AS發(fā)生率明顯增高(P<0.05),而HDF組減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組炎癥狀態(tài)指標比較

2.2各組腎功能情況 治療前,與N組相比,HD、HDF組SCr、BUN水平明顯升高(P<0.01),HD組與HDF組以上指標無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組治療前腎功能及治療后NF-κB p65、MCP-1蛋白表達比較

2.3各組NF-κB p65、MCP-1蛋白表達比較 治療3個月后,與N組比較,HD及HDF組MCP-1蛋白表達明顯升高(P<0.05),HD組NF-κB p65蛋白表達明顯增高(P<0.05),HDF組NF-κB p65蛋白表達無明顯變化(P>0.05);與HD組比較,HDF組以上兩種蛋白表達明顯受到抑制(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組治療3個月后NF-κB p65、MCP-1蛋白表達

3 討 論

研究顯示,CKD各階段中均存在微炎癥狀態(tài)〔1〕,隨著CKD分期增加,炎癥狀態(tài)血清標志物也呈上升趨勢,同時其體內(nèi)增高的多種細胞因子可以不同形式激活NF-κB〔2〕。NF-κB是一種特異結(jié)合的核蛋白因子,其通路的靶基因主要包括:①細胞因子類如 TNF、IL-1β、IL-6 等;②趨化因子類如MCP等;③急性期反應(yīng)蛋白如 C-反應(yīng)蛋白(CRP)〔3〕。已有許多學(xué)者認為,NF-κB的激活與動脈粥樣硬化的發(fā)生關(guān)系密切,NF-κB的激活伴隨的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1等的表達,在促炎因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞的炎癥、外周血單核細胞和血管內(nèi)皮細胞的激活和血液凝固中起著至關(guān)重要的作用,同時也影響平滑肌細胞生長,促進AS形成〔2,4～6〕。目前多個研究證實,NF-κB可能參與AS 形成的血管炎癥的起始和進展:AS起始階段,內(nèi)皮細胞的NF-κB信號通路的激活能導(dǎo)致靶基因的表達,包括細胞間黏附分子(ICAM)-1、血管細胞黏附分子(VCAM)-1、E-選擇素(selectin)、細胞因子、趨化因子等,這些靶基因可誘導(dǎo)炎癥細胞募集到血管床,形成動脈粥樣斑塊〔7〕。AS進展期,單核細胞移行到內(nèi)膜下,進而衍生為巨噬細胞。進而分化為泡沫細胞〔8〕。Brand 等〔9〕在主動脈粥樣損傷中發(fā)現(xiàn)有NF-κB p65的激活,早期損傷時內(nèi)皮細胞上有NF-κB的覆蓋;進入損傷進展期,在平滑肌細胞、巨噬細胞和T-淋巴細胞上也可檢測到NF-κB的激活。張耀等〔10〕也發(fā)現(xiàn),慢性腎衰竭血清對兔主動脈內(nèi)皮細胞NF-κB信號通路有明顯活化的作用,并影響內(nèi)皮細胞的增殖與凋亡,從而促進AS形成。而動脈硬化是一種進行性血管炎性反應(yīng),以累及冠狀動脈、主動脈、腦動脈多見,并可使受累血管管腔狹窄、閉塞,其導(dǎo)致的心血管疾病是腎臟病患者死亡率高的主要原因〔11〕。所以,阻斷NF-κB信號通路激活的干預(yù)性治療在減少維持性HD患者AS發(fā)病率上具有重要意義。

在慢性腎衰竭患者的替代治療中,血液凈化是臨床上重要的治療手段,包括HD、HDF等血液凈化方式。HD 通過彌散有效清除患者體內(nèi)小分子毒素及代謝廢物,平衡體內(nèi)酸堿代謝并保持電解質(zhì)平衡。但因HD彌散受透析膜分子孔徑限制,對循環(huán)血中大分子的炎癥因子清除率減低。HDF更加有效地清除小、中、大分子尿毒毒素,故臨床上HDF 常應(yīng)用于維持性HD治療中〔12〕。炎癥因子IL分子量為24 000～31 000 D,TNF分子量為35 000～225 000 D,均屬中大分子,在HF方式的有效清除范圍內(nèi)。已有大量研究資料表明,HDF通過清除各種分子大小的代謝物質(zhì),減少單核細胞活化,從而抑制CRP及其他炎癥因子的釋放〔13〕;同時通過直接加強維持HD患者體內(nèi)CRP、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8及CD14+、CD16+的清除,進一步治療CRF患者的微炎癥狀態(tài)〔14〕。另外,HDF治療時透析液需通過二級細菌過濾器,有效防止透析液細菌污染,加之HDF治療時使用的濾器具有比透析器更好的生物相容性,故能更好阻止微炎癥狀態(tài)的產(chǎn)生。本研究說明,HDF治療通過抑制NF-κB p65蛋白表達,降低下游因子IL-6、IL-8、TNF-ɑ、hs-CRP、MCP-1血清水平而阻止AS發(fā)生。

綜上,HDF是CDK5期維持性HD患者重要治療手段,可以減輕其微炎癥狀態(tài),阻止AS發(fā)生。