朱明錦 張永樂(lè) 張軍芳 方誠(chéng)冰 張永華

(浙江省立同德醫(yī)院 1康復(fù)醫(yī)學(xué)科,浙江 杭州 310012;2檢驗(yàn)科;3杭州市中醫(yī)院)

我國(guó)腦卒中的發(fā)病率高,尤其易在老年人群中發(fā)生,有些患者在腦卒中事件發(fā)生中除了肢體偏癱,還可能繼發(fā)認(rèn)知功能障礙和睡眠障礙。高齡、多種血管危險(xiǎn)因素、關(guān)鍵部位梗死、腦局部代謝與血流動(dòng)力學(xué)改變等多種機(jī)制可能參與腦卒中后認(rèn)知障礙、睡眠障礙的發(fā)病過(guò)程〔1〕。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后一個(gè)重要的組學(xué),可以用來(lái)研究生物或細(xì)胞中的內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律,對(duì)特定生物樣品中的小分子代謝物進(jìn)行定量評(píng)估,從而在代謝特征和疾病表型之間建立聯(lián)系〔2〕,分析導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,其已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域〔3〕。在過(guò)去幾年,代謝組學(xué)在預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)、早期診斷及評(píng)估、生物標(biāo)志及機(jī)制等方面顯示出了其優(yōu)勢(shì)〔4～7〕。腦卒中的發(fā)生存在腦血管和腦實(shí)質(zhì)的損傷,其損傷過(guò)程可能由炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂、糖代謝紊亂引起,針對(duì)腦卒中疾病的研究,代謝組學(xué)在生物標(biāo)記方面更有優(yōu)勢(shì),因?yàn)槠淠軌驒z測(cè)易穿過(guò)血腦屏障的小分子代謝物〔8〕。有學(xué)者通過(guò)代謝組學(xué)分析腦卒中患者與健康個(gè)體之間的血漿和尿液代謝物,發(fā)現(xiàn)兩組存在明顯差異,這些差異代謝產(chǎn)物與無(wú)氧糖酵解、高同型半胱氨酸血癥有關(guān)〔9〕。有學(xué)者研究了腦卒中后認(rèn)知障礙患者和腦卒中非認(rèn)知障礙患者血清代謝組學(xué)差異,找出了3種血清代謝產(chǎn)物(谷氨酰胺、犬尿氨酸和溶血卵磷脂)作為腦卒中后認(rèn)知障礙的候選生物標(biāo)志物〔10〕。有研究通過(guò)代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),睡眠限制患者脂質(zhì)代謝水平發(fā)生顯著變化〔11〕,推測(cè)出線粒體脂肪酸氧化受到急性睡眠限制的影響〔12〕。因此,本研究擬通過(guò)血清代謝組學(xué)方法探討缺血性腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠患者與單純老年腦卒中患者存在的差異代謝物表達(dá),從而進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其可能存在的信號(hào)通路,為藥物干預(yù)靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 于2018年8月至2020年12月就診于浙江省立同德醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科門診及住院患者18例〔9例腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠為T組,9例單純腦卒中(C)組〕。收集年齡、性別、病程、合并疾病匹配的兩組患者。該項(xiàng)目通過(guò)醫(yī)院倫理會(huì)員會(huì)審批。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 觀察組納入標(biāo)準(zhǔn):(1) 符合腦卒中的診斷:參考2005年《中國(guó)腦血管病防治指南》〔13〕腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)頭顱CT或磁共振成像(MRI)確診的腦梗死患者;(2) 符合腦卒中后認(rèn)知功能障礙的診斷:診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2017年《卒中后認(rèn)知障礙管理專家共識(shí)》〔14〕:腦卒中發(fā)生6個(gè)月內(nèi),認(rèn)知篩查中執(zhí)行功能/注意力、記憶、語(yǔ)言能力、視空間能力4個(gè)領(lǐng)域至少1個(gè)認(rèn)知域受損。Hachinski缺血指數(shù)量表總分≥7分;(3) 符合失眠診斷:參考《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(第五版)》〔15〕(DSM-5)的失眠診斷部分和2017年《中國(guó)成人失眠癥診斷與治療指南》〔16〕:包括入睡困難、睡眠維持困難、比期望的起床時(shí)間更早醒來(lái)、在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間不愿意上床睡覺(jué),包括急性或短期失眠;(4) 年齡60～85歲;(5) 意識(shí)清楚,能自我表達(dá),無(wú)明顯語(yǔ)言理解障礙,能完成大部分量表測(cè)評(píng);(6) 患者或其法定委托人知情同意。觀察組排除標(biāo)準(zhǔn):(1) 腦卒中后伴有意識(shí)不清或病情嚴(yán)重以致不能配合相關(guān)檢查的患者;(2) 嚴(yán)重的精神障礙或既往有精神疾病病史;(3) 伴有完全失語(yǔ)、嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙等不能配合檢查的患者;(4) 合并有嚴(yán)重的其他軀體疾病不能配合檢查或評(píng)估的患者;(5) 發(fā)病前已經(jīng)在治療睡眠障礙、認(rèn)知障礙(例如阿爾茨海默病)的患者。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):符合腦梗死診斷,腦卒中事件發(fā)生在6個(gè)月內(nèi),但不伴有認(rèn)知障礙和睡眠障礙者;排除標(biāo)準(zhǔn)同觀察組。

1.3研究方法 選取年齡、性別、病程、合并疾病匹配患者,-80 ℃保存血清樣本,采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)進(jìn)行血清非靶向代謝組學(xué)研究。

1.3.1血清標(biāo)本采集 患者于夜間10點(diǎn)后禁食,保持情緒穩(wěn)定,于晨起空腹采集肘正中靜脈血5 ml,送至醫(yī)院生物樣本室進(jìn)行標(biāo)本離心分離操作,3 000 r/min離心5 min,收集上清液放入-80 ℃深低溫冰箱凍存?zhèn)浯x組學(xué)檢測(cè)。

1.3.2代謝組學(xué)檢測(cè) 將-80 ℃下保存的樣本取出,室溫解凍,吸取100 μl血清與300 μl的甲醇-乙腈混合震蕩,4 ℃下離心,取上清液,-80 ℃下保存,待進(jìn)行LC-MS分析。分析儀器為Nexera UPLC超高效液相儀(日本島津)串聯(lián)QE高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技)組成的液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm;美國(guó)沃特世);流動(dòng)相:A-水(含0.1%甲酸),B-乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.35 ml/min;柱溫:45 ℃。洗脫梯度見(jiàn)表1。質(zhì)譜條件:電噴霧,樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。掃描范圍質(zhì)荷比(m/z):125-1000;毛細(xì)管溫度(℃):320;分辨率(全掃描):70 000;霧化氣壓(V):正離子3 500、負(fù)離子-3 000;鞘氣流速(Arb):正離子40、負(fù)離子35;輔助氣流速(Arb):正離子10、負(fù)離子8。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度(%)

1.3.3基線資料比較 血清代謝組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)每組各有一個(gè)樣本分析結(jié)果離群嚴(yán)重,影響模型穩(wěn)定性,經(jīng)分析核查仍無(wú)法明確離群原因,故剔除該兩個(gè)樣本,因此,T組和C組每組各8例納入代謝組學(xué)分析。兩組年齡、性別、病程等一般情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見(jiàn)表2。

表2 兩組基線資料比較〔n(%),n=8〕

1.4數(shù)據(jù)處理 UNIFI1.8.1軟件采集原始數(shù)據(jù);原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI v2.3軟件進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化,其主要參數(shù)為:precursor tolerance:5 ppm;product tolerance:10 ppm;product ion threshold:5%?；衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級(jí)碎片及同位素分布,通過(guò)使用 The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(v2.3)及Metabolite Link(Metlin)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性。對(duì)提取到的數(shù)據(jù),刪除組內(nèi)缺失值均(0值)>50%的離子峰,并將0值以最小值的一半替換,并根據(jù)化合物定性結(jié)果打分,對(duì)定性得到的化合物進(jìn)行篩選,篩選標(biāo)準(zhǔn)為30分,30分以下視為定性結(jié)果不準(zhǔn)確并刪除。最后將正負(fù)離子數(shù)據(jù)合并成一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣表,進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn),R語(yǔ)言ropls包進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與單變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.1多元統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)進(jìn)行分析,根據(jù)OPLS-DA模型得到變量權(quán)重(VIP)值,其中VIP>1為潛在的生物標(biāo)志物。將 VIP值>1且P<0.05 的代謝物定義為顯著差異代謝物。

1.5.2單變量分析 包括單變量的描述和統(tǒng)計(jì)推斷兩個(gè)方面,用t檢驗(yàn)和變異倍數(shù)分析比較各組之間的差異代謝產(chǎn)物。

1.5.3代謝通路富集分析 應(yīng)用 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/)進(jìn)行通路富集分析,得到與差異代謝物相關(guān)的重要通路。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)量控制 質(zhì)控樣本(QC)的PCA,經(jīng)7次循環(huán)交叉驗(yàn)證得到的PCA模型圖,QC樣本緊密聚集在一起,表明此實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性較好,見(jiàn)圖1。

圖1 QC樣本PCA

2.2兩組PCA比較 PCA是一種非監(jiān)督分析,對(duì)代謝物進(jìn)行PCA,反映樣本組間和組內(nèi)的變異度,觀察樣本間的總體分布趨勢(shì)。腦卒中T組和C組的PCA模型顯示兩組樣本存在分離趨勢(shì)(R2X=0.515),每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本。PCA表明兩組樣本之間存在代謝差異,見(jiàn)圖2。

圖2 兩組PCA比較

2.3兩組PLS-DA比較 PLS-DA是一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)方法,驗(yàn)證PCA模型可靠性。PLS-DA可使組間區(qū)分最大化。兩組樣本間存在顯著代謝差異(模型參數(shù)具有3個(gè)主成成分,R2X=0.412,R2Y=0.997,Q2=0.729),參數(shù)接近1 表示模型擬合數(shù)據(jù)效果好,故此模型預(yù)測(cè)能力較好,可以利用該數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,見(jiàn)圖3。

圖3 兩組PLS-DA比較

2.4OPLS-DA OPLS-DA是在PLS-DA基礎(chǔ)上進(jìn)行的衍生算法,提高了模型的解析能力和有效性,最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別間的差異。OPLS-DA分析結(jié)果得到1個(gè)主成成分和2個(gè)正交成分,參數(shù)R2X=0.412,R2Y=0.997,Q2=0.806,提示兩組間存在差異,見(jiàn)圖4。為防止模型過(guò)擬合,采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)的方法來(lái)考察模型質(zhì)量,結(jié)果顯示該模型穩(wěn)定性好(R2=0.92,Q2=-0.289),見(jiàn)圖5。

圖4 兩組OPLS-DA比較

圖5 200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)

2.5單變量統(tǒng)計(jì)分析 利用火山圖對(duì)P值和差異倍數(shù)(FC)值進(jìn)行可視化,篩選出所有差異代謝物,如圖6所示,其中紅色圓點(diǎn)代表在顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物,藍(lán)色圓點(diǎn)代表顯著下調(diào)的差異代謝物,灰色點(diǎn)代表不顯著的差異代謝產(chǎn)物。

圖6 兩組差異代謝物火山圖

2.6兩組差異的代謝標(biāo)志物及其代謝通路 將兩組共篩選出差異代謝產(chǎn)物606種,因兩組差異代謝物多,故增加差異倍數(shù)以做進(jìn)一步篩選,選擇FC>1.2和FC<0.83,以篩選出差異更顯著的代謝產(chǎn)物,得到差異代謝產(chǎn)物394種。再根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩組差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行富集通路分析,一共篩選出37種富集到通路的差異代謝物,其中有11種代謝產(chǎn)物為工業(yè)或食品添加劑和藥物成分,予排除,故有26種差異代謝物,見(jiàn)表3。

表3 兩組差異性代謝產(chǎn)物比較

3 討 論

越來(lái)越多的研究表明,心腦血管疾病的發(fā)生與代謝紊亂密切相關(guān),代謝組學(xué)已成為心腦血管疾病研究的有力工具,生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)有助于心腦血管疾病的早期診斷和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)〔17,18〕。

氨基酸為蛋白質(zhì)最基本的組成單位,參與體內(nèi)多種活性物質(zhì)的合成與代謝,氨基酸是人體內(nèi)某些激素和低分子量含氮物質(zhì)合成的關(guān)鍵前體,具有重大的生物學(xué)意義。在正常生理狀態(tài)下,人體內(nèi)氨基酸處于動(dòng)態(tài)平衡,病理狀態(tài)時(shí)會(huì)出現(xiàn)失衡〔19〕。研究表明,老年癡呆患者大腦中的氨基酸水平和相關(guān)化合物的代謝狀態(tài)發(fā)生異常,使突觸傳遞功能降低,而造成認(rèn)知功能損害和記憶力下降〔20〕。本研究顯示,兩組與氨基酸代謝有關(guān)的代謝產(chǎn)物有半胱氨酸硫酸酯和左旋精氨酸。半胱氨酸硫酸酯在腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組中表達(dá)增高,半胱氨酸硫酸酯參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝,其含量增高與腦損傷和精神發(fā)育遲滯有關(guān)〔21〕。研究證實(shí)同型半胱氨酸升高與機(jī)體衰老相關(guān),是心血管病和神經(jīng)退行性疾病的危險(xiǎn)因素〔22〕,且與血管性癡呆等認(rèn)知功能障礙有關(guān)〔23,24〕。因此,本研究受試者半胱氨酸硫酸酯含量升高導(dǎo)致認(rèn)知、睡眠障礙是因?yàn)橹苯幼饔?還是因?yàn)殚g接存在和同型半胱氨酸之間的聯(lián)系而介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞損傷值得研究。左旋精氨酸在一氧化氮(NO)合酶(NOS)催化下產(chǎn)生NO,即左旋精氨酸是NO合成的前體,NO在大腦中可作為神經(jīng)遞質(zhì),參與疼痛及認(rèn)知記憶等功能〔25〕。非靶向代謝組學(xué)研究表明,左旋精氨酸/NO代謝途徑是AD病變的途徑之一〔26〕。血管內(nèi)皮NO缺乏會(huì)加速淀粉樣β肽形成,降低突觸可塑性,激活小膠質(zhì)細(xì)胞和引發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)而導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變〔27〕。本研究發(fā)現(xiàn),單純老年腦卒中患者代謝產(chǎn)物中精氨酸含量減少,可能由于單純腦卒中患者大腦中誘導(dǎo)型iNOS活性增強(qiáng)而增加了精氨酸的利用率。

脂類代謝是代謝組學(xué)的一個(gè)重要分支,是動(dòng)植物代謝中的第一大類,參與生物體物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳導(dǎo)、能量傳遞及代謝調(diào)控等重要功能。許多疾病與脂代謝異常有關(guān),如代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等〔28〕。對(duì)真核生物來(lái)說(shuō),至少有4種脂代謝組學(xué)網(wǎng)絡(luò)在大多數(shù)脂類中是必不可少的,包括鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、甘油脂類代謝和脂肪酸代謝〔29〕。

人體中最重要的兩種多不飽和酸是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA),已被證實(shí)對(duì)炎癥、心腦血管疾病有積極作用〔30〕,有臨床研究發(fā)現(xiàn)其能改善輕度認(rèn)知障礙患者的大腦區(qū)域灌注,延緩癡呆進(jìn)展〔31〕。二十二碳二烯酸也是一種多不飽和脂肪酸,但是本研究結(jié)果顯示腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠患者血清代謝產(chǎn)物中二十二碳二烯酸表達(dá)增高,不能解釋其優(yōu)勢(shì),可能對(duì)認(rèn)知和睡眠方面起積極意義的主要是DHA和EPA,故需進(jìn)一步研究。類花生酸(8-HETE),又稱類二十烷酸,是由含二十個(gè)碳的多不飽和脂肪酸(花生四烯酸)衍生而來(lái)的具有生物活性的脂類物質(zhì),可抑制炎癥反應(yīng)〔32〕。本研究顯示,類花生酸在腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組的表達(dá)高,可能是因?yàn)槟X卒中后認(rèn)知、失眠障礙者存在炎性狀態(tài),類花生酸聚集而起到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。6-酮-前列腺素F1α是一組有20個(gè)碳原子組成的不飽和脂肪酸,是花生四烯酸代謝過(guò)程中的重要成分,與血栓素B2一起參與血栓形成過(guò)程,腦梗死患者血栓素B2/前列腺素F1α比例升高,與其體內(nèi)脂質(zhì)紊亂有關(guān)〔33〕。和其他兩種不飽和脂肪酸一樣,本研究顯示,6-酮-前列腺素F1α含量在腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組高,因此不飽和脂肪酸可能并未在腦卒中后認(rèn)知障礙、失眠障礙起到保護(hù)作用。二十二烷酸和棕櫚酸是飽和脂肪酸,飽和脂肪酸的過(guò)多攝入,如棕櫚油和棕櫚酸會(huì)導(dǎo)致肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥〔34,35〕。高熱量、高飽和脂肪酸飲食會(huì)顯著增加老年AD風(fēng)險(xiǎn)〔36〕。本研究顯示,二十二烷酸和棕櫚酸兩種飽和脂肪酸在腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組表達(dá)上調(diào),飽和脂肪酸含量過(guò)高可能不利于腦卒中患者認(rèn)知和睡眠狀態(tài)。

鞘脂類包含鞘磷脂、神經(jīng)酰胺類、腦苷類等,在細(xì)胞生物反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用,對(duì)維持細(xì)胞膜的完整性及在信號(hào)傳遞通路中有重要意義〔37〕。神經(jīng)酰胺是參與動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過(guò)程中關(guān)鍵的活性信號(hào)分子,介導(dǎo)細(xì)胞脂毒性反應(yīng),破壞內(nèi)皮細(xì)胞功能,參與激活血小板引起血栓,可預(yù)測(cè)不良心血管事件〔38〕,神經(jīng)酰胺還參與多種代謝綜合征的發(fā)生,如脂肪肝〔39〕、肥胖〔40〕、胰島素抵抗〔41〕。神經(jīng)鞘氨醇磷酸膽堿是高密度脂蛋白的重要組成部分,對(duì)調(diào)節(jié)心臟和血管的病理過(guò)程中具有一定作用〔42〕。神經(jīng)鞘氨醇可被鞘氨醇激酶催化生成1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(S1P),S1P通路在減輕腦神經(jīng)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮作用〔43〕,二氫神經(jīng)鞘氨醇是神經(jīng)鞘氨醇的前體。S1P和神經(jīng)酰胺在參與神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的生存和死亡調(diào)控過(guò)程中,兩者功能在多方面互相拮抗,本研究代謝組學(xué)結(jié)果顯示,腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組的神經(jīng)酰胺表達(dá)低,S1P相關(guān)的二氫神經(jīng)鞘氨醇表達(dá)高,這與相關(guān)研究〔44〕關(guān)于癡呆和衰老中鞘脂表達(dá)趨勢(shì)的描述相左,故需要研究。

常見(jiàn)的甘油磷脂有磷脂酰膽堿(PC),磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酸(PA),磷脂酰絲氨酸(PS),磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)和雙磷脂酰甘油(DPG,又稱心磷脂)〔45〕。其中PC和PE是細(xì)胞膜中最豐富的脂質(zhì),占總磷脂種類的一半以上,在維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)女性睡眠剝奪期間的血漿代謝產(chǎn)物變化中,減少最顯著的是PC〔46〕。血漿PC的基線水平越高,老年人的認(rèn)知表現(xiàn)下降越慢〔47〕。PE是哺乳動(dòng)物發(fā)育所需的多功能磷脂,影響許多膜蛋白的穩(wěn)定性和功能,其水平升高可增加γ-分泌酶活性和Aβ的產(chǎn)生,可能導(dǎo)致AD發(fā)生,但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚〔48〕。本研究血清代謝組學(xué)結(jié)果顯示,6種PC在認(rèn)知障礙伴失眠組下調(diào),與文獻(xiàn)關(guān)于認(rèn)知障礙的研究一致〔49〕,PC俗稱卵磷脂,對(duì)人體有益,腦卒中后伴有認(rèn)知和睡眠障礙者,可能與PC水平降低有關(guān)。其中1種PC〔22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)/22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)〕在不伴有認(rèn)知睡眠障礙者含量上調(diào),其原因尚不能解釋,可能因?yàn)楸狙芯繉?duì)象包含失眠癥狀,有代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪患者主要表現(xiàn)為PC含量上調(diào)為主〔50〕,故需要研究。本研究代謝組學(xué)結(jié)果顯示腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組的1種PE表達(dá)升高,而另1種表達(dá)下降,有研究調(diào)查了腦脊液PE濃度與認(rèn)知障礙程度的相關(guān)性,無(wú)論縱向還是橫向比較,均未發(fā)現(xiàn)有顯著相關(guān)性〔51〕,因此,不能認(rèn)為PE是腦卒中后認(rèn)知障礙的危險(xiǎn)因素。

本研究結(jié)果顯示,兩組還有5種差異代謝產(chǎn)物:次黃嘌呤、尿苷二磷酸葡萄糖、異丙腎上腺素、睪酮和左旋肉堿。次黃嘌呤是核苷代謝產(chǎn)物,在缺血缺氧狀態(tài)下可誘導(dǎo)三磷酸腺苷(ATP)分解產(chǎn)生肌苷和次黃嘌呤,如心肌缺血缺氧發(fā)作時(shí),ATP大量消耗分解供能,次黃嘌呤為小分子易物質(zhì)擴(kuò)散入血,出現(xiàn)急性期次黃嘌呤濃度升高〔52〕。研究表明,缺血缺氧的過(guò)程中ATP代謝在所有細(xì)胞中都普遍存在,不僅限于腦缺血、心臟缺血,ATP的代謝產(chǎn)物腺苷、肌苷和次黃嘌呤被釋放到中樞和外周血液、腦脊液和間質(zhì)液中,可作為體內(nèi)缺血的生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)和定量〔53〕。但也有研究認(rèn)為缺血性腦卒中患者急性期血清次黃嘌呤水平較正常組水平降低〔54〕。本研究提示,腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組較單純腦卒中組大腦中缺血缺氧程度可能更嚴(yán)重。

有研究表明,尿苷二磷酸葡萄糖能改善因缺血誘導(dǎo)的大鼠腦白質(zhì)病變,可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化成熟,并促進(jìn)軸突生長(zhǎng)〔55〕。本研究發(fā)現(xiàn),腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組尿苷二磷酸葡萄糖含量水平顯著低于對(duì)照組,可能因?yàn)檎J(rèn)知障礙與腦白質(zhì)病變有關(guān)〔56〕,而尿苷二磷酸葡萄糖缺乏可能加重血管性認(rèn)知障礙程度。睪酮是由男性睪丸或女性卵巢分泌的一種類固醇激素,大型的前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)較低的循環(huán)睪酮預(yù)示著較高心血管事件及腦卒中發(fā)生率〔57〕。學(xué)者發(fā)現(xiàn),睪酮水平下降可能是老年認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔58〕,但Kaufman等〔59〕的系統(tǒng)綜述研究表明睪酮水平對(duì)老年男性認(rèn)知功能下降的影響有限。睪酮水平降低與睡眠呼吸暫停有關(guān)〔60〕,但失眠與睪酮水平無(wú)關(guān)〔61〕。本研究顯示,腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠組睪酮偏高,可能與樣本量不足有關(guān),不能認(rèn)為睪酮在兩組的差異有臨床意義。左旋肉堿是脂肪酸β-氧化代謝過(guò)程中重要的物質(zhì),實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)左旋肉堿及其乙?；苌镌谀X損傷模型中能改善能量代謝,減少氧化應(yīng)激,起到神經(jīng)保護(hù)作用〔62〕。Chen等〔63〕的系統(tǒng)綜述提示,暫不認(rèn)可左旋肉堿對(duì)健康成人認(rèn)知增強(qiáng)的有效性或安全性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),左旋肉堿含量在腦卒中后認(rèn)知障礙伴失眠患者組升高,可能的原因是在腦卒中后失眠患者能量消耗偏高,需要更多的左旋肉堿參與脂肪酸代謝,但仍需要研究證實(shí)。異丙腎上腺素是一種β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑,能夠通過(guò)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激,誘發(fā)凋亡自噬作用于心肌組織,可以引起心肌損傷,常被用來(lái)做誘發(fā)動(dòng)物心肌損傷的模型〔64〕,本研究?jī)山M均未使用異丙腎上腺素藥物,其差異是否由人體自身分泌所致尚不可知,故暫不能解釋兩組差異的原因。

本研究存在不足之處,首先在于樣本量不足,老年患者合并基礎(chǔ)疾病多,體質(zhì)不盡相同,且腦卒中病情輕重、病程長(zhǎng)短等因素可能對(duì)代謝組學(xué)研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚。有研究提出,在涉及腦卒中患者的代謝分析中,由于疾病嚴(yán)重程度、發(fā)病時(shí)間、種族、飲食、年齡和其他患者特征的限制,其代謝物上調(diào)或下調(diào)模式存在差異,此外,詳細(xì)的病因評(píng)估對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化也是必要的〔65〕。本文只研究了腦卒中后認(rèn)知障礙組和單純腦卒中組,還欠缺一個(gè)健康對(duì)照組,樣本量偏少可能會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果偏倚。腦卒中患者常伴有多種慢性疾病,如糖尿病、冠心病、高脂血癥等,可能會(huì)導(dǎo)致基線不均衡,故本研究采用匹配對(duì)照設(shè)計(jì),使兩組基線盡量均衡,需要進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。