丁朦燕 李予林

(舟山醫(yī)院甲狀腺外科,浙江 舟山 316000)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)是常見的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,調(diào)查顯示其占甲狀腺癌病理類型的70%～80%〔1,2〕?，F(xiàn)階段,放射性碘和手術(shù)是PTC重要治療手段,且可獲得良好整體預(yù)后,但仍存在轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的可能,導(dǎo)致患者生命健康受到嚴(yán)重威脅〔3～5〕。因此,探索與PTC預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物可用于指導(dǎo)臨床治療。B-Raf原癌基因(BRAF)是RET原癌基因、RAS原癌基因下游信號分子,在多種腫瘤發(fā)生過程中該基因編碼產(chǎn)物可通過表皮生長因子受體(EGFR)信號轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮關(guān)鍵作用,與細(xì)胞周期進(jìn)程、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成等密切相關(guān)〔6〕。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因主要是由Carol學(xué)者在1985年發(fā)現(xiàn),其啟動子區(qū)C250T和C228T突變可使甲狀腺癌的進(jìn)程加速,但TERT基因突變與PTC病理和預(yù)后相關(guān)性仍存在爭議〔7〕。本文旨在探討老年P(guān)TC患者BRAF基因和TERT基因表達(dá)情況及其與病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對象 選擇浙江省舟山醫(yī)院于2021年1月至2022年9月收治的老年P(guān)TC患者81例,年齡65～81歲,平均(72.34±5.15)歲;納入標(biāo)準(zhǔn):(1)依據(jù)《甲狀腺結(jié)節(jié)和分化型甲狀腺癌診治指南》〔8〕關(guān)于PTC標(biāo)準(zhǔn);(2)經(jīng)病理證實為PTC;(3)年齡≥65歲;(4)臨床資料、病理資料和隨訪資料完整;(5)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并重癥內(nèi)科疾病;(2)其他部位惡性腫瘤者;(3)肝、腎、心、肺臟器嚴(yán)重異常者;(4)合并內(nèi)分泌相關(guān)疾病病史者;(5)精神疾病者;(6)失訪或不配合隨訪者。

1.2DNA提取 取PTC組織以10%中性甲醛緩沖液固定,石蠟包埋樣品后進(jìn)行基因突變檢測。應(yīng)用DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)提取DNA。提取DNA后迅速檢測。石蠟切片樣品的DNA在檢測前使用pH8.0的1倍TE稀釋濃度至1～3 ng/μl。將DNA按照FFPE樣本保存時間稀釋至1～3 ng/μl。樣本DNA分離后,DNA濃度采用Nanodrop2000測定,放于-70 ℃下保存待測。

1.3BRAF基因突變檢測 采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定BRAF基因突變情況,應(yīng)用人類BRAF基因突變檢測試劑盒(廣州好芝生物科技有限公司)測定。通過定量(q)PCR法提取DNA定量,在實時PCR放入混合好的DNA樣本測定。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,1個循環(huán);95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環(huán);93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,31個循環(huán)。60 ℃時收集FAM信號,執(zhí)行實時PCR。按照不同突變Ct值判定結(jié)果。樣品FAM信號Ct值<28提示存在樣本突變陽性。

1.4TERT基因突變檢測 采用突變擴(kuò)增系統(tǒng)PCR法測定TERT基因突變情況,應(yīng)用人類TERT基因突變檢測試劑盒(廣州好芝生物科技有限公司)測定。檢測TERT啟動子區(qū)C228、C250位點突變。根據(jù)TH反應(yīng)液:TH混合酶35 μl∶0.3 μl比例,從反應(yīng)液管中取出相應(yīng)反應(yīng)液,再根據(jù)比例加入TH混合液,進(jìn)行振蕩充分混合均勻15 s,快速離心15 s,取每管35.3 μl分裝至PCR管中。加入需檢測的4.7 μl樣品、4.7 μl TH陽性對照和4.7 μl陽性對照,將PCR管蓋小心蓋上,快速離心15 s。PCR放入實時PCR儀器。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min,1個循環(huán);95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個循環(huán);93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,31個循環(huán)。60 ℃時收集FAM信號,執(zhí)行實時PCR。按照不同突變Ct值判定結(jié)果。樣品FAM信號Ct值<26提示存在樣本突變陽性。

1.5病歷資料收集 病歷資料包括性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤數(shù)目、脈管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

1.6預(yù)后評價 所有患者完成隨訪1年,觀察復(fù)發(fā)和生存率情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗及多因素Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1不同病理特征BRAF、TERT基因突變發(fā)生情況比較 81例患者發(fā)生BRAF基因突變57例(70.37%),TERT基因突變42例(51.85%)。不同性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、脈管侵犯BRAF、TERT基因突變率無顯著差異(P>0.05);Ⅲ、Ⅳ期BRAF、TERT基因突變率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移BRAF、TERT基因突變率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。見表1。

表1 不同病理特征BRAF、TERT基因突變發(fā)生情況比較〔n(%)〕

2.2BRAF基因突變與無BRAF基因突變復(fù)發(fā)和1年生存率比較 隨訪1年,復(fù)發(fā)23例(28.40%);1年生存70例(86.42%)。BRAF基因突變復(fù)發(fā)率〔20例(35.09%)〕顯著高于無BRAF基因突變〔3例(12.50%);χ2=4.238,P=0.040〕,1年生存率〔46例(80.70%)〕顯著低于無BRAF基因突變〔24例(100.00%);χ2=3.841,P=0.049〕。

2.3TERT基因突變與無TERT基因突變復(fù)發(fā)和1年生存率比較 TERT基因突變復(fù)發(fā)率〔18例(42.86%)〕顯著高于無TERT基因突變〔5例(12.82%);χ2=8.973,P=0.003〕,1年生存率〔33例(78.57%)〕顯著低于無TERT基因突變〔37例(94.87%);χ2=4.578,P=0.032〕

2.4多因素Logistic回歸分析影響老年P(guān)TC患者預(yù)后危險因素 以病歷資料為自變量。以預(yù)后為自變量,其中0=良好,1=不良。經(jīng)多因素Logistic回歸分析顯示,Ⅲ和Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、BRAF基因突變和TERT基因突變?yōu)橛绊懤夏關(guān)TC患者預(yù)后危險因素(P<0.05)。見表2。

表2 多因素Logistic回歸分析影響老年P(guān)TC患者預(yù)后危險因素

3 討 論

甲狀腺癌主要是起源于濾泡上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤,其組成包括多種惡性表型,包括高分化、低分化及未分化的甲狀腺癌,而其中的高分化甲狀腺癌分為PTC和濾泡性甲狀腺癌〔9～11〕。大部分PTC患者惡性程度低、生長緩慢、潛伏時間長且病死率低,但由于PTC早期容易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,即時采取根治性手術(shù),仍存在術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險,從而導(dǎo)致患者生存質(zhì)量下降〔12～14〕。故而,探討與PTC相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志物對患者預(yù)后評估、指導(dǎo)治療及臨床診斷具有重要意義。

BRAF基因是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的關(guān)鍵成員之一,主要位于RAS基因下游。BRAF基因狀態(tài)對多種惡性腫瘤患者預(yù)后評估具有重要價值〔15〕。郭曼等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),甲狀腺微小乳頭狀癌(PTMC)伴頸中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者與無頸中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者BRAF基因突變(+)比較無顯著差異,而BRAF基因突變(+)患者縱橫比≥1明顯高于BRAF基因突變(-),存在微鈣化的比例低于BRAF基因突變(-)。樊菁等〔17〕研究顯示,BRAF V600E基因突變率為89.3%,可見PTC患者中BRAF V600E基因突變率較高。本研究表明,BRAF基因突變與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),臨床分期越高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)BRAF基因突變率越高;BRAF基因突變患者復(fù)發(fā)率越高,且1年生存率越低;BRAF基因突變?yōu)橛绊懤夏關(guān)TC患者預(yù)后的危險因素。端粒酶主要是由多亞基組成的一種核糖核蛋白酶,具有轉(zhuǎn)錄活性,其中一部分由TERT基因編碼,具有催化作用。人TERT基因組成包含15個內(nèi)含子和16個外顯子,處于人5號染色體短臂上。TERT基因啟動子區(qū)GC豐富,具有多個調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)合位點,能夠?qū)蜣D(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。TERT基因與端粒酶激活有關(guān),且與腫瘤細(xì)胞的調(diào)控和增殖關(guān)系緊密〔18～20〕。本研究表明,TERT基因突變與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),臨床分期越高及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者出現(xiàn)TERT基因突變率越高;且TERT基因突變患者復(fù)發(fā)率越高,且1年生存率越低;TERT基因突變?yōu)橛绊懤夏關(guān)TC患者預(yù)后危險因素。

綜上,老年P(guān)TC患者BRAF基因突變和TERT基因突變發(fā)生率較高,且與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),為影響老年P(guān)TC患者預(yù)后危險因素。