謝耕耘 安曉燕 王佳

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常見的口腔癌類型,局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率以及遠(yuǎn)處器官的侵襲是OSCC相關(guān)死亡的主要原因[1-2]。目前對于OSCC的診斷和治療水平有了很大的提升,但相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明OSCC晚期患者的5年生存率依然居高不下[3]。因此,深入研究調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的分子生物標(biāo)志物,可能為OSCC的早期診斷和治療提供新的機(jī)會。環(huán)狀RNA(Circular RNA, CircRNA)是一種特殊類型的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,越來越多的證據(jù)表明CircRNA在OSCC進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。已有研究報(bào)道,環(huán)狀RNABICD2(CircBICD2)在OSCC組織和細(xì)胞中高表達(dá), 干擾CircBICD2可抑制OSCC細(xì)胞增殖、遷移侵襲, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]。但CircBICD2調(diào)控OSCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的具體分子機(jī)制尚不完全明確。已有文獻(xiàn)闡明CircRNA-miRNA-mRNA 信號軸參與OSCC的發(fā)生和進(jìn)展[6]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與Ras同源基因家族成員A(Ras Homolog Gene Family Member A,RhoA)存在結(jié)合位點(diǎn)。相關(guān)研究顯示,沉默miR-218-5p可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖[7];過表達(dá)RhoA可促進(jìn)OSCC細(xì)胞遷移與侵襲[8]。而CircBICD2能否通過調(diào)控miR-218-5p/RhoA軸影響OSCC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為尚不清楚。本研究主要探究CircBICD2對OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集及細(xì)胞來源

25 對OSCC組織及癌旁組織(距離癌組織3 cm處)來自于2018 年9 月～2021 年9 月期間在本院首次確診為OSCC的患者。所有患者均提供知情同意書,且本研究獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號: R-202209)。

人口腔上皮細(xì)胞系HOEC及OSCC細(xì)胞系HSC-4、CAL-27、SCC-15(浙江美森細(xì)胞科技有限公司)。

1.2 主要試劑

Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(XYS0185,上海信裕生物公司);CCK-8試劑盒(MH1003,江蘇麥格生物公司);兔源一抗波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、RhoA、神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin)、GAPDH及羊抗兔IgG二抗(貨號:ab8978、ab76055、ab187027、ab245117、ab9484、ab6721)(Abcam公司,英國)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HOEC、HSC-4、CAL-27、SCC-15細(xì)胞。將SCC-15細(xì)胞分為si-NC組(B:轉(zhuǎn)染si-NC)、si-CircBICD2組(C:轉(zhuǎn)染si-CircBICD2)、miR-NC組(D:轉(zhuǎn)染mimic NC)、miR-218-5p組(E:轉(zhuǎn)染miR-218-5p mimic)、si-CircBICD2+anti-NC組(F:同時(shí)轉(zhuǎn)染si-CircBICD2和anti-NC)、si-CircBICD2+anti-miR-218-5p 組(G:同時(shí)轉(zhuǎn)染si-CircBICD2和anti-miR-218-5p),另將未經(jīng)任何處理的SCC-15細(xì)胞命名為Ct組(A)。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h。

1.4 qRT-PCR檢測CircBICD2和miR-218-5p表達(dá)

向組織勻漿和細(xì)胞中加入TRIzol,用于分離并提取總RNA,將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后開始進(jìn)行定量反應(yīng)。CircBICD2、miR-218-5p的相對表達(dá)量是分別以GAPDH、U6為內(nèi)參,通過2-ΔΔct法計(jì)算的。引物序列:GAPDH:正向5′-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3′,反向5′-GGTGGAATCATATTGGAACA-3′;CircBICD2:正向5′-TTGGCTCTCCTGCTGTGC-3′,反向5′-GGTCATCCACAATCAGCCCA-3′;U6:正向5′-CG-CTTCGGCAGCACATATAC-3′,反向5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-218-5p:正向5′-AACACGAACTAGATTGGTACA-3′,反向5′-AGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將各組SCC-15細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)加入到96 孔板中孵育48 h,再向各孔加入10 μL CCK-8試劑在37 ℃下孵育2 h。通過酶標(biāo)儀檢測A值(450 nm處)。

1.6 細(xì)胞克隆形成的檢測

將SCC-15細(xì)胞(280 個(gè))放入細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)15 d后,除去培養(yǎng)液,將細(xì)胞經(jīng)甲醇固定、結(jié)晶紫染色后,開始觀察細(xì)胞克隆形成。

1.7 細(xì)胞凋亡的檢測

將各組SCC-15細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次。然后將細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的濃度重新懸浮在1×結(jié)合緩沖液中。取100 μL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到5 mL培養(yǎng)管中。將5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶添加到樣品中,然后在室溫下避光孵15 min。將400 mL 1×結(jié)合緩沖液添加到每個(gè)管中,并立即通過流式細(xì)胞術(shù)分析樣品。FlowJo軟件用于數(shù)據(jù)分析。

1.8 RhoA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的檢測

組織勻漿以及細(xì)胞樣品在RIPA緩沖液中裂解以獲得總蛋白。取出40 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS/PAGE,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉后,在4 ℃下將膜與一抗RhoA(1∶1 000)、E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶4 000)、GAPDH(1∶3 000)孵育過夜,再在25 ℃下與二抗(1∶3 000) 一起孵育2 h。通過ImageJ軟件評估蛋白灰度值。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)造BICD2野生型質(zhì)粒(BICD2-WT)、突變型質(zhì)粒(BICD2-MUT)、RhoA野生型質(zhì)粒(RhoA-WT)和突變型質(zhì)粒(RhoA-MUT),將BICD2-WT、BICD2-MUT、RhoA-WT、RhoA-MUT分別與miR-218-5p mimic或mimic NC共轉(zhuǎn)染于SCC-15細(xì)胞,48 h后,統(tǒng)計(jì)熒光素酶活性的變化。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 在組織和細(xì)胞中CircBICD2、 miR-218-5p表達(dá)及RhoA蛋白表達(dá)情況

與癌旁組織相比,OSCC組織中CircBICD2表達(dá)及RhoA蛋白表達(dá)量升高,miR-218-5p相對表達(dá)量降低(P<0.05)(圖1A, 表1);與HOEC細(xì)胞比較,HSC-4、CAL-27、 SCC-15細(xì)胞中CircBICD2、 RhoA蛋白表達(dá)升高,miR-218-5p表達(dá)降低,且SCC-15細(xì)胞中CircBICD2、RhoA蛋白表達(dá)量最高,miR-218-5p表達(dá)量最低, 因此, 選取SCC-15細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(圖1B, 表2)。

表1 在組織中CircBICD2、miR-218-5p表達(dá)及RhoA蛋白表達(dá)比較

表2 在細(xì)胞中CircBICD2、 miR-218-5p表達(dá)及RhoA蛋白表達(dá)比較

圖1 組織中RhoA蛋白的表達(dá)(Western blot)

2.2 CircBICD2、miR-218-5p、RhoA蛋白在SCC-15細(xì)胞中的表達(dá)

與Ct組、si-NC組比較,si-CircBICD2組CircBICD2、RhoA蛋白表達(dá)降低,miR-218-5p表達(dá)升高(P<0.05);與Ct組、miR-NC組相比,miR-218-5p組CircBICD2表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),RhoA蛋白表達(dá)下調(diào),miR-218-5p表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與si-CircBICD2組、si-CircBICD2+anti-NC組相比,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組CircBICD2表達(dá)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-218-5p表達(dá)降低,RhoA蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(圖2, 表3)。

表3 各組SCC-15細(xì)胞中CircBICD2、miR-218-5p表達(dá)及RhoA蛋白表達(dá)比較

圖2 各組SCC-15細(xì)胞中RhoA蛋白的表達(dá)(Western blot)

2.3 沉默CircBICD2或過表達(dá)miR-218-5p抑制SCC-15細(xì)胞增殖

與Ct組、si-NC組相比,si-CircBICD2組A450值及克隆形成率顯著降低(P<0.05);與Ct組、miR-NC組相比,miR-218-5p組A450值、克隆形成率顯著降低(P<0.05);與si-CircBICD2組和si-CircBICD2+anti-NC組相比,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組SCC-15細(xì)胞A450值、克隆形成率升高(P<0.05)(圖3, 表4)。

表4 各組SCC-15細(xì)胞A450值、克隆形成率、凋亡率比較

圖3 沉默CircBICD2或過表達(dá)miR-218-5p對SCC-15細(xì)胞克隆形成的影響

2.4 下調(diào)CircBICD2或上調(diào)miR-218-5p促進(jìn)SCC-15細(xì)胞凋亡

與Ct組、si-NC組對比,si-CircBICD2組SCC-15細(xì)胞凋亡率上升(P<0.05);與Ct組、miR-NC組比較,miR-218-5p組SCC-15細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與si-CircBICD2組、si-CircBICD2+anti-NC組比較,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組SCC-15細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)(圖4, 表4)。

圖4 各組SCC-15細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞術(shù))

2.5 沉默CircBICD2或過表達(dá)miR-218-5p對SCC-15細(xì)胞EMT的影響

與Ct組、si-NC組對比,si-CircBICD2組E-cadherin蛋白上調(diào)表達(dá),N-cadherin、Vimentin蛋白下調(diào)表達(dá)(P<0.05);與Ct組、miR-NC組比較,miR-218-5p組E-cadherin蛋白上調(diào)表達(dá),N-cadherin、Vimentin蛋白下調(diào)表達(dá)(P<0.05);與si-CircBICD2組、si-CircBICD2+anti-NC組相比,si-CircBICD2+anti-miR-218-5p組E-cadherin蛋白下調(diào)表達(dá),N-cadherin、Vimentin蛋白上調(diào)表達(dá)(P<0.05)(圖5、 表5)。

表5 各組SCC-15細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較

圖5 各組SCC-15細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)(Western blot)

2.6 CircBICD2靶向調(diào)控miR-218-5p/RhoA軸

starbase預(yù)測CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與RhoA的結(jié)合位點(diǎn)(圖6)。與mimic NC和BICD2-WT共轉(zhuǎn)染組相比,miR-218-5p mimic和BICD2-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性下調(diào)(P<0.05);與mimic NC和BICD2-MUT共轉(zhuǎn)染組對比,miR-218-5p mimic和BICD2-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化不顯著(P>0.05)。miR-218-5p mimic和RhoA-WT共轉(zhuǎn)染組SCC-15細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于mimic NC和RhoA-WT共轉(zhuǎn)染組(P<0.05);與mimic NC和RhoA-MUT共轉(zhuǎn)染組相比,miR-218-5p mimic和RhoA-MUT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性變化差異不顯著(P>0.05)(表6)。

表6 熒光素酶活性比較

圖6 Starbase預(yù)測CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與RhoA的結(jié)合位點(diǎn)

3 討 論

CircRNA呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),由于其特殊的結(jié)構(gòu),使CircRNAs比其線性mRNAs更穩(wěn)定,這確保了它們的高度保守性[9]。據(jù)報(bào)道,CircRNA在人類腫瘤中表達(dá)異常,參與了腫瘤的進(jìn)展[10]。如CircBICD2在OSCC 組織和細(xì)胞系中上調(diào),抑制其表達(dá)顯著降低了OSCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[11];下調(diào)CircBICD2抑制了肝癌細(xì)胞增殖[12]。以上研究表明CircBICD2在OSCC、肝癌等腫瘤中具有促癌的作用。

本研究顯示, CircBICD2在OSCC組織以及OSCC細(xì)胞CAL-27、HSC-4、SCC-15中CircBICD2呈高表達(dá)狀態(tài),且SCC-15細(xì)胞中CircBICD2表達(dá)量最高,因此研究對象指定為SCC-15細(xì)胞。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用,其涉及細(xì)胞極性喪失和細(xì)胞間粘附過程,使腫瘤細(xì)胞具有遷移和轉(zhuǎn)移的能力[13]。E-cadherin、N-cadherin、Vimentin是參與腫瘤細(xì)胞EMT的重要蛋白質(zhì),N-cadherin和vimentin的減少和E-cadherin的增加通常預(yù)示著EMT受到抑制[14]。本研究顯示,沉默CircBICD2可抑制SCC-15細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá),促進(jìn)E-cadherin表達(dá),提示,沉默CircBICD2可抑制SCC-15細(xì)胞EMT過程。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)沉默CircBICD2可抑制SCC-15細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

CircRNA可通過海綿化miRNA來調(diào)控腫瘤進(jìn)展[15]。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)CircBICD2可與miR-218-5p靶向結(jié)合。miR-218-5p作為一種miRNA,相關(guān)研究表明,下調(diào)miR-218-5p可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡[16];上調(diào)miR-218-5p抑制了喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[17];沉默miR-218-5p可促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT[18]。表明miR-218-5p在骨肉瘤、喉鱗狀細(xì)胞癌、胃癌等腫瘤中具有抑癌的作用。本研究闡明,在OSCC組織及細(xì)胞中miR-218-5p低表達(dá),過表達(dá)miR-218-5p可抑制SCC-15細(xì)胞增殖和EMT,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),沉默CircBICD2后,SCC-15細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)升高,且雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了CircBICD2與miR-218-5p的靶向關(guān)系,推測沉默CircBICD2可能通過上調(diào)miR-218-5p表達(dá)抑制SCC-15細(xì)胞增殖和EMT,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證該假設(shè),本研究在下調(diào)CircBICD2的基礎(chǔ)上再通過抑制miR-218-5p表達(dá)的方式來干預(yù)SCC-15細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),anti-miR-218-5p減弱了沉默CircBICD2對SCC-15細(xì)胞增殖和EMT的抑制作用以及對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。證實(shí)了猜想是正確的。

miRNAs是一類小的單鏈非編碼RNA,調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的穩(wěn)定性[19]。miRNA參與一系列生理活動(dòng),包括新陳代謝、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生[20]。本研究為了進(jìn)一步闡明CircBICD2靶向miR-218-5p調(diào)控OSCC細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。本研究證實(shí)了RhoA為miR-218-5p的靶基因。RhoA是一種Rho家族GTP酶,它是細(xì)胞骨架功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,RhoA激活已被證明可促進(jìn)體外和體內(nèi)腫瘤發(fā)生[21]。據(jù)報(bào)道,上調(diào)RhoA可促進(jìn)OSCC細(xì)胞增殖和遷移[22]。提示RhoA在OSCC中發(fā)揮癌基因的作用。本研究顯示,在OSCC組織和細(xì)胞中RhoA蛋白上調(diào)表達(dá),沉默CircBICD2后,SCC-15細(xì)胞中miR-218-5p表達(dá)升高,RhoA蛋白表達(dá)降低;過表達(dá)miR-218-5p后,SCC-15細(xì)胞中RhoA蛋白表達(dá)降低,且CircBICD2與miR-218-5p、miR-218-5p與RhoA存在靶向結(jié)合關(guān)系,證明了沉默CircBICD2可能通過上調(diào)miR-218-5p來抑制RhoA表達(dá),進(jìn)而抑制SCC-15細(xì)胞增殖和EMT,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述,沉默CircBICD2可能通過調(diào)控miR-218-5p/RhoA軸來抑制SCC-15細(xì)胞增殖、EMT,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究證明了CircBICD2/miR-218-5p/RhoA軸參與OSCC的腫瘤發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)揭示了OSCC中一個(gè)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并可能有助于確定OSCC的新治療靶點(diǎn)。