李逸舒 屠淑貞

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)占口腔惡性病變的90%以上,全世界每年約有30萬新病例報告,患者5 年總生存率不足50%[1-3]。長非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)異常表達已被證實參與口腔癌前病變[4-9]。研究顯示橫紋肌肉瘤2相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(rhabdomyosarcoma 2 associated transcript, RMST)能夠抑制乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移,抑制膠質(zhì)瘤細胞線粒體自噬發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[10]。miR-24是一種腫瘤調(diào)控因子,在許多腫瘤組織中異常高表達[11-12]。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)RMST和miR-24-3p可能存在靶向關(guān)系。本研究主要探討RMST靶向miR-24-3p調(diào)控OSCC增殖、遷移和侵襲進程及分子機制。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析

UALCAN數(shù)據(jù)庫分析癌癥基因圖譜頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC)組織中RMST表達。

1.2 實驗材料

人口腔角質(zhì)細胞NHOK和OSCC細胞株SCC25、HN6、HN4、Tca8113和CAL27(中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所)。

1.3 實驗試劑

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000(Thermo Fisher公司,美國);RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司,美國);熒光定量試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司,日本);MTT檢測試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒、pmirGLO reporter、pcDNA3.1空載體和RMST過表達載體(pcDNA3.1-RMST)(南京曼夫特生物科技有限公司);miR-24-3p mimics、NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);兔源一抗E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)、c-myc(transcriptional regulator Myc-like)、GAPDH及HRP標記的二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

1.4 細胞培養(yǎng)及處理

將2.5 μg pcDNA3.1空載、RMST過表達載體pcDNA3.1-RMST和miR-24-3p mimics與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000混合孵育。細胞生長至密度60%更換無血清培養(yǎng)基,加入轉(zhuǎn)染混合液。將CAL27細胞分為:control組(A)、pcDNA3.1組(B)、pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組(C)和pcDNA3.1-RMST+miR-24-3p mimics組(D)。

1.5 熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗

細胞處理48 h后加入800 μL Trizol試劑裂解細胞,加入200 μL氯仿提取細胞總RNA。使用分光光度計檢測RNA濃度,挑選A260/A280在1.8～2.0之間的RNA樣本進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后以此cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s; 40 個循環(huán)的95 ℃ 5 s; 60 ℃ 30 s。本實驗中RMST、E-cadherin、N-cadherin和c-myc的表達使用GAPDH作為內(nèi)參,miR-24-3p的表達使用U6作為內(nèi)參,定量結(jié)果采用2-ΔΔCt表示。

1.6 雙熒光報告檢測實驗

通過PCR擴增miR-24-3p與RMST結(jié)合的種子序列,雙酶切法將擴增片段插入雙熒光報告質(zhì)粒pmirGLO,得到熒光報告質(zhì)粒pRMST,構(gòu)建突變質(zhì)粒pMut-RMST。將miR-24-3p mimics和陰性對照分別與報告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染, 24 h后檢測細胞熒光素酶活性。

1.7 MTT檢測細胞增殖

分別在轉(zhuǎn)染0、 24、 48、 72 h加入濃度5 μg/μL的MTT工作溶液,孵育4 h加入DMSO溶液。利用酶標儀測定490 nm的波長下吸光度A值。

1.8 細胞劃痕實驗

使用無菌槍頭,垂直細胞劃一條直線,顯微鏡下觀察并拍照。置于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24 h之后,顯微鏡下觀察并拍照。根據(jù)公式劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%,計算24 h細胞劃痕愈合率。

1.9 細胞侵襲實驗

Transwell小室底部加入100 μL工作液水化基底膜,風(fēng)干后加入100 μL培養(yǎng)基靜置。細胞按照1×105/孔密度接種至小室,下室加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h。 4%多聚甲醛固定30 min, 0.1%晶紫染液工作液染色20 min,顯微鏡下觀察并照相。

1.10 Western blot實驗

RIPA提取細胞總蛋白。每孔加樣40 μg,加入緩沖液混勻,沸水蒸煮蛋白質(zhì)變性。SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜, 5% BSA封閉2 h。4 ℃條件過夜孵育一抗。次日室溫條件孵育二抗1 h。避光環(huán)境曝光顯影。以目標條帶與內(nèi)參光密度比值作為蛋白相對表達量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 OSCC組織RMST表達

UALCAN數(shù)據(jù)庫分析顯示RMST在HNSC組織中低表達(P<0.01)(圖1A)。且RMST表達與HNSC患者臨床分期相關(guān)(圖1B)。

圖1 HNSC組織中RMST的表達

2.2 OSCC細胞中RMST和miR-24-3p表達

RMST在OSCC細胞SCC25、HN6、HN4、Tca8113和CAL27中的相對表達水平低于NHOK細胞(P<0.05)(圖2A);miR-24-3p在OSCC細胞SCC25、HN6、Tca8113和CAL27的相對表達水平高于NHOK細胞(P<0.05)(圖2B)。

圖2 RMST和miR-24-3p在OSCC細胞系中的表達

2.3 pcDNA3.1-RMST和miR-24-3p mimics轉(zhuǎn)染效率

pcDNA3.1-RMST組CAL27細胞中RMST相對表達水平高于pcDNA3.1組(P<0.01),見圖3A。miR-24-3p mimics組CAL27細胞中miR-24-3p相對表達水平高于mimics-NC組(P<0.01)(圖3B)。說明pcDNA3.1-RMST和miR-24-3p mimics轉(zhuǎn)染效果顯著。

圖3 pcDNA3.1-RMST和miR-24-3p mimics在CAL27細胞中轉(zhuǎn)染效率

2.4 RMST靶向調(diào)控miR-24-3p

在線DIANA tools LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示RMST序列中含有miR-24-3p互補結(jié)合核苷酸序列(圖4A)。熒光素酶基因報告檢測顯示,轉(zhuǎn)染miR-24-3p mimics抑制野生型RMST的細胞熒光素酶活性(P<0.01),而對突變型RMST的細胞熒光素酶活性影響無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B)。pcDNA3.1-RMST組miR-24-3p的相對表達水平低于pcDNA3.1組(P<0.01)(圖4C)。

圖4 RMST靶向調(diào)控miR-24-3p表達

2.5 RMST靶向miR-24-3p抑制CAL27細胞增殖

pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組CAL27細胞增殖活力低于pcDNA3.1組(P<0.01);pcDNA3.1-RMST+miR-24-3p mimics組CAL27細胞活力高于pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組(P<0.01)(圖5)。

2.6 RMST靶向miR-24-3p抑制CAL27細胞遷移

pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組細胞劃痕愈合率低于pcDNA3.1組(38.707%±2.545vs86.910%±2.342,P<0.01);另外,pcDNA3.1-RMST+miR-24-3p mimics組細胞劃痕愈合率高于pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組(83.990%±2.677,P<0.01)(圖6)。

圖6 RMST靶向miR-24-3p影響CAL27細胞遷移(×100)

2.7 RMST靶向miR-24-3p抑制CAL27細胞侵襲

pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組細胞穿膜數(shù)量少于pcDNA3.1組(24.333個±1.764vs80.667個±3.383,P<0.01);另外,pcDNA3.1-RMST+miR-24-3p mimics組細胞穿膜數(shù)量多于pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組(75.333個±5.783,P<0.01)(圖7)。

圖7 RMST通過靶向miR-24-3p影響CAL27細胞侵襲(×100)

2.8 RMST通過靶向miR-24-3p影響CAL27細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達

相較于pcDNA3.1組,pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組E-cadherin表達升高,N-cadherin和c-myc表達降低(P<0.01)。相較于pcDNA3.1-RMST+mimics-NC組,pcDNA3.1-RMST+miR-24-3p mimics組E-cadherin表達降低,N-cadherin和c-myc表達升高(P<0.01)(圖8)。

圖8 RMST靶向miR-24-3p影響CAL27細胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子表達

3 討 論

E-cad、 N-cad、 c-myc在腫瘤中意義,及與RMST、miR-24-3p的相關(guān)性及在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等中的意義尚需進一步理順及完善。

LncRNA在OSCC等腫瘤疾病中發(fā)揮多種功能。RMST最初被鑒定是橫紋肌肉瘤中潛在功能性非編碼RNA[13],隨后被證實對大腦發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生至關(guān)重要[14]。最近,人們逐漸開始關(guān)注RMST在腫瘤生理中的作用。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)低表達RMST的三陰性乳腺癌患者總生存期更短。Wang等[16]證實RMST抑制三陰性乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移,促進細胞凋亡,調(diào)節(jié)細胞周期,發(fā)揮抑癌作用。最近,有學(xué)者通過芯片分析發(fā)現(xiàn)RMST在OSCC組織中表達異常,可能和has-mir-204/211/31發(fā)生互作[17]。然而目前RMST在OSCC生物學(xué)過程中功能尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)RMST在HNSC組織中低表達,檢測發(fā)現(xiàn)其在OSCC細胞中表達量減少,其中CAL27細胞中表達量僅為NHOK細胞約0.46倍。CAL27細胞中構(gòu)建RMST過表達載體,檢測發(fā)現(xiàn)增強RMST表達明顯抑制CAL27細胞的增殖、遷移和侵襲，同時上調(diào)細胞中E-cadherin的表達、下調(diào)N-cadherin和c-myc的表達。E-cadherin在細胞間粘附中起核心作用，其表達喪失是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的標志之一，而EMT被認為是轉(zhuǎn)移的早期關(guān)鍵步驟[18-19]。E-cadherin表達的缺失通常伴隨著間充質(zhì)和細胞外基質(zhì)生物標志物N-cadherin、MMP-9和波形蛋白(vimentin)水平的增加。 c-myc對維持上皮源性癌癥轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它可以通過TGF-β/Snail和RhoA信號通路等激活EMT表型，使E-cadherin表達喪失，進而引起腫瘤細胞侵襲和遷移[20]。通過上述結(jié)果可知RMST影響OSCC細胞增殖和轉(zhuǎn)移惡性表型，參與OSCC的腫瘤發(fā)展，然而RMST調(diào)控OSCC的機制尚不清楚。

LncRNAs可以通過ceRNA機制參與調(diào)控癌癥進程[21-22]。本研究預(yù)測并結(jié)合雙熒光基因報告確認miR-24-3p是RMST的靶miRNA,RMST能夠通過互補結(jié)合負調(diào)控miR-24-3p的表達。最近,唾液外泌體miR-24-3p被發(fā)現(xiàn)能夠作為OSCC篩選的新型診斷生物標志物,并且通過靶向PER1維持OSCC細胞增殖[23]。為驗證RMST調(diào)控OSCC惡性表型是否通過靶向miR-24-3p實現(xiàn),在轉(zhuǎn)染RMST過表達載體基礎(chǔ)上加入miR-24-3p mimics,檢測發(fā)現(xiàn)miR-24-3p過表達處理明顯逆轉(zhuǎn)RMST對CAL27細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,同時下調(diào)E-cadherin表達、上調(diào)N-cadherin和c-myc的表達。有研究證實miR-24可以靶向調(diào)控c-myc表達,消除c-myc過表達對腫瘤細胞侵襲的促進作用,并與E-cadherin表達恢復(fù)有關(guān)抑制EMT過程[24]。由此可見RMST能夠通過競爭性靶向并抑制miR-24-3p表達,上調(diào)癌基因c-myc和N-cadherin、下調(diào)E-cadherin表達,加速OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲。先前有研究報道,RMST能夠結(jié)合miR-204-5p、 miR-377等影響大腦微血管內(nèi)皮細胞損傷和神經(jīng)元凋亡[25-26]。目前需要大量研究進一步證實RMST利用ceRNA機制調(diào)控腫瘤進程。

綜上所述,RMST在OSCC細胞中表達水平異常降低,過表達RMST可能通過負調(diào)控miR-24-3p抑制OSCC細胞的增殖、遷移與侵襲,在OSCC發(fā)展中發(fā)揮腫瘤抑制基因作用。本研究仍具有局限性,在今后的研究中將深入探究miR-24-3p下游調(diào)控靶點,并在動物水平進行驗證。