傅慧敏,蘇芝敏,2*,王巧環(huán),孟 齡

(1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 城市與區(qū)域生態(tài)國家重點實驗室,北京 100085;2.北京京津冀區(qū)域生態(tài)環(huán)境變化與綜合治理國家野外科學(xué)觀測研究站,北京 100085)

蝴蝶對環(huán)境的依賴程度較高,其生存環(huán)境的氣候變化、食物來源等都會直接影響區(qū)域內(nèi)蝴蝶的種類和數(shù)量,因此蝴蝶可作為研究生態(tài)環(huán)境的指標(biāo)[1-2]。國內(nèi)對蝴蝶的研究主要是以采集后分類為主,較少用穩(wěn)定同位素技術(shù)判定蝴蝶的生活習(xí)性。研究表明,昆蟲的穩(wěn)定同位素比值可以直觀地展現(xiàn)昆蟲的遷徙、食物來源、營養(yǎng)級、溯源等信息[3-12]。目前昆蟲的穩(wěn)定同位素比值檢測,一般選用全蟲[4,12]或者頭部[13]、腿部[14]、翅膀[15]等不同部位進(jìn)行脫脂或不脫脂處理[8,16],脫脂試劑一般為不同體積比的甲醇-三氯甲烷的混合溶液[4,7-8,17],沒有統(tǒng)一明確的試驗方案,而昆蟲的選擇部位和前處理有可能會影響數(shù)據(jù)的可靠性。

本工作選用個頭較大的活大帛斑蝶,對其不同部位和經(jīng)不同配比的脫脂試劑脫脂后的翅膀進(jìn)行輕元素穩(wěn)定同位素比值(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值)的測定,考察差異性,從而確定蝴蝶輕元素穩(wěn)定同位素比值的測定方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Flash EA 2000 HT型元素分析儀;DELTA V Advangtage型穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀。

甲醇為色譜純;三氯甲烷為分析純;試驗用水為超純水。

5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)見表1(V-PDB表示碳穩(wěn)定同位素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);AIR表示氮穩(wěn)定同位素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì);V-SMOW表示氧、氫穩(wěn)定同位素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì));5只人工養(yǎng)殖的同批次活大帛斑蝶購自同一網(wǎng)店,編號S1～S5。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

1.2 儀器工作條件

利用元素分析儀,碳、氮元素經(jīng)燃燒還原分別轉(zhuǎn)化成CO2和N2,氫、氧元素經(jīng)高溫裂解分別轉(zhuǎn)化為H2和CO。待測元素轉(zhuǎn)化為目標(biāo)氣體后,由連續(xù)流接口引入穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀;各待測元素穩(wěn)定同位素比值的儀器工作參數(shù)見表2。

表2 儀器工作參數(shù)

1.3 試驗方法

1.3.1 樣本預(yù)處理

將活蝴蝶樣本用少量水沖洗,自然風(fēng)干。用鑷子和剪刀將每只蝴蝶分解成6個部分：頭部、左翅、右翅、腿部、胸部、腹部,然后分別放置于干凈的燒杯中。

未脫脂處理：將頭部、左翅、腿部、胸部、腹部樣本放置于60 ℃的烘箱中烘干,研磨并儲存于密封性好的玻璃瓶中,其中左翅部位烘干后先剪碎再研磨。

脫脂處理：用水浸泡右翅樣本30 min,再用體積比2…1的甲醇-三氯甲烷混合溶液(A)或體積比1…2的甲醇-三氯甲烷混合溶液(B)浸泡2 h; 棄去混合溶液,用水清洗兩次并浸泡30 min,再用A或B浸泡2 h,取出,用水清洗3次,置于60 ℃烘箱中烘干,剪碎后研磨,并儲存于密封性好的玻璃瓶中。

1.3.2 穩(wěn)定同位素比值的測定

考慮到不同元素需要的樣本量可能不同,若選擇一次進(jìn)樣多元素同時測定,則需要利用氦氣稀釋過量的氣體產(chǎn)物,這會引起測定誤差。為了避免稀釋帶來誤差,預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)測定δ13C值需要0.08 mg樣本,測定δ15N值需要0.40 mg,測定δ2H和δ18O值均需要0.20 mg。因此,分別稱取約0.08,0.40 mg研磨好的樣本包入錫杯中,用于δ13C和δ15N值的測定;稱取約0.20 mg樣本包入銀杯中,用于δ2H和δ18O值的同時測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 校準(zhǔn)曲線

同位素測定數(shù)據(jù)的校正可采用兩點或多點法(兩個或多個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))[18],因此試驗選用B2203、B2205、CBS這3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正δ2H和δ18O值,選用B2157、B2205、IVA33802174這3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校正δ15N和δ13C值。以儀器測定值為橫坐標(biāo),各元素穩(wěn)定同位素比值的標(biāo)準(zhǔn)值為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表3。

表3 校準(zhǔn)曲線

2.2 樣本分析

按照試驗方法對5只蝴蝶樣本進(jìn)行預(yù)處理和測定,每個樣本取兩份,結(jié)果見表4。為了比較不同部位的穩(wěn)定同位素比值差異,首先對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗。δ13C和δ15N值不滿足正態(tài)分布條件,因此采用Kruskal-Wallis(克魯斯卡爾-沃利斯)檢驗判定不同部位之間的差異顯著性,差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)時采用Tukey法進(jìn)行多重比較;δ18O和δ2H值滿足正態(tài)分布條件,因此采用One way ANOVA(單因素方差分析)判定不同部位之間的差異顯著性,差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)時采用Holm-Sidak法進(jìn)行多重比較,結(jié)果見表4;其中同一行不含相同字母的部位表示差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

表4 蝴蝶不同部位的穩(wěn)定同位素比值

由表4可知：蝴蝶不同部位的δ13C和δ2H值差異分別達(dá)到顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.001)水平;蝴蝶翅膀的δ13C值最高,右翅(B)與頭、胸、腹三個部位之間的δ13C值差異達(dá)到顯著水平,頭、胸、腹部位之間的δ13C值沒有顯著差異;蝴蝶腹部的δ2H值最高,且與其他部位的δ2H值均有顯著差異,而其他部位之間的δ2H值沒有顯著差異;左翅和右翅(A、B兩種脫脂處理)的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的測定結(jié)果均無顯著差異,可見對翅膀脫脂與否,以及兩種配比的脫脂試劑對δ13C、δ15N、δ2H、δ18O值的測定結(jié)果無影響。這些現(xiàn)象可能是因為內(nèi)臟器官的存在以及蝴蝶攝取食物的差異而產(chǎn)生的。

當(dāng)需要利用穩(wěn)定同位素技術(shù)分析蝴蝶的食源、分布以及遷徙活動等信息時,直接將其翅膀或腿部烘干、粉碎研磨后取樣進(jìn)行檢測,無需進(jìn)行脫脂處理,以減少有機(jī)試劑對環(huán)境的污染;若是需要對蝴蝶食源進(jìn)行研究,建議取其腹部內(nèi)容物進(jìn)行檢測。