蒲文靜,白 瑩,董 娜,張愛菊,張小林

(甘肅醫(yī)學(xué)院,平?jīng)?744000)

過氧化氫酶(CAT)是人體組織中重要的抗氧化酶,具有積極的防御功能[1-2],能夠清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物H2O2,阻止H2O2進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氧化性更強(qiáng)的羥自由基(·OH)。近年來,血清CAT活性作為腫瘤和抗衰老有關(guān)的指標(biāo)而備受關(guān)注。傳統(tǒng)CAT活性測定方法包括滴定法[3]、比色法[4]、光度法[5-7]等。以羅丹明類染料作為探針的熒光分光光度法在生物檢測和藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[8-9]。文獻(xiàn)[10]基于碘-羅丹明B締合反應(yīng)的靜態(tài)熒光猝滅原理測定CAT活性,該方法有較寬的檢測范圍(1.5×10-4～9×10-3U·mL-1)和較低的檢出限(5×10-6U·mL-1),可用于魚肝提取液中CAT活性分析。

丁基玫瑰紅B(BRMB)又名丁基羅丹明B、四乙基羅丹明丁酯,其結(jié)構(gòu)中含有C=N基團(tuán)[11],在釋放熒光的同時很容易被H2O2氧化,出現(xiàn)瞬間熒光猝滅現(xiàn)象[12];CAT屬于血紅蛋白酶,具有電子傳遞作用,能分解部分H2O2。因此,本工作利用CAT活性對H2O2-BRMB-Fe2+體系熒光變化程度的影響,提出了基于H2O2-BRMB-Fe2+體系的熒光猝滅法測定血清CAT活性的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

930N型熒光分光光度計。

1 mmol·L-1H2O2底液：用水將30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)H2O2溶液稀釋500倍,高錳酸鉀法測其濃度為19.5 mmol·L-1,再用水二次稀釋至1 mmol·L-1,備用。

1 U·mL-1CAT標(biāo)準(zhǔn)溶液：取CAT標(biāo)準(zhǔn)品5 mg,用水溶解并稀釋至100 mL,碘量法[13]測其活性為100 U·mL-1,再用水二次稀釋至1 U·mL-1,備用。

0.02 mmol·L-1BRMB溶液：取0.010 7 g BRMB,用水溶解并稀釋至1 000 mL,備用。

0.01 mol·L-1Fe2+溶液：取0.278 0 g FeSO4·7H2O,用水溶解并稀釋至100 mL,備用。

0.1 mol·L-1冰乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)：取乙酸鈉1.79 g,加入冰乙酸4.46 mL,再用水稀釋至1 000 mL,備用。

CAT標(biāo)準(zhǔn)品為優(yōu)級純;30%H2O2溶液、BRMB、FeSO4·7H2O均為分析純;試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

取血清樣品10 μL,加入1 mmol·L-1H2O2底液0.50 mL,于30 ℃恒溫反應(yīng)15 min,再依次加入0.02 mmol·L-1BRMB溶液0.70 mL、0.1 mol·L-1冰乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.2)1.00 mL、0.01 mol·L-1Fe2+溶液0.08 mL,混勻,于室溫反應(yīng)20 min后用水定容至10 mL,靜置1 min。以水為參比,設(shè)置激發(fā)波長為365 nm,在1 cm吸收池中測定上述體系在590 nm發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度F;以煮死酶液為對照,按照同樣的方法測定其在590 nm發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度F0,以熒光強(qiáng)度差值ΔF(ΔF=F-F0)計算CAT活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜圖

圖1為不同體系的熒光光譜圖(激發(fā)波長為365 nm),其中BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,CAT活性為0.05 U·mL-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1。

1-BRMB;2-H2O2+BRMB+Fe2+;3-CAT+H2O2+BRMB+Fe2+圖1 熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra

結(jié)果表明：BRMB于590 nm處產(chǎn)生明顯的熒光發(fā)射峰(曲線1);H2O2既是氧化劑又是還原劑,在冰乙酸-乙酸鈉緩沖液中,H2O2氧化BRMB,使BRMB的熒光基團(tuán)遭到破壞,出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象(曲線2);CAT是分解H2O2的專一酶,H2O2的分解在一定程度上恢復(fù)了BRMB的熒光(曲線3),其恢復(fù)程度與CAT活性有關(guān)。

2.2 熒光猝滅條件的選擇

2.2.1 催化劑

試驗(yàn)分別考察了Fe2+、Fe3+對H2O2和BRMB反應(yīng)催化性能的影響,所得熒光光譜圖見圖2,其中cBRMB=1.4 μmol·L-1,cH2O2=0.05 mmol·L-1,cFe2+=80.0 μmol·L-1,cFe3+=80.0 μmol·L-1。

1-BRMB+H2O2/Fe2+;2-H2O2+BRMB+Fe2+;3-H2O2+BRMB+Fe3+;4-BRMB+Fe3+圖2 Fe2+、Fe3+對體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effects of Fe2+ and Fe3+ on the fluorescence intensity

結(jié)果表明：在BRMB溶液中只加入H2O2,熒光強(qiáng)度基本不變(曲線1);在H2O2和BRMB混合溶液中分別加入Fe2+、Fe3+后,均出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象(曲線2、3),而Fe2+產(chǎn)生的猝滅現(xiàn)象更明顯(曲線2);當(dāng)不存在H2O2,Fe2+、Fe3+分別與BRMB混合時,Fe2+對BRMB無影響(曲線1),而Fe3+亦可使熒光猝滅(曲線4),說明Fe3+是反應(yīng)物而非催化劑。因此,試驗(yàn)選擇以Fe2+作為H2O2氧化BRMB的催化劑。

2.2.2 BRMB濃度

BRMB濃度直接影響后續(xù)酶活性的測定范圍,濃度偏小,線性范圍變窄;濃度過大,締合作用導(dǎo)致體系穩(wěn)定性變差,酶活性測定準(zhǔn)確度受影響。在冰乙酸-乙酸鈉緩沖液中,單獨(dú)考察了BRMB濃度對其熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明：熒光強(qiáng)度隨著BRMB濃度的增大而增大,并且BRMB濃度在1.4 μmol·L-1以內(nèi)與對應(yīng)的熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。因此,試驗(yàn)選擇BRMB的濃度為1.4 μmol·L-1。

2.2.3 酸度

試驗(yàn)考察了酸度對BRMB熒光釋放和H2O2-BRMB-Fe2+體系熒光猝滅的影響。結(jié)果表明：在強(qiáng)酸性環(huán)境中,質(zhì)子化作用削弱了BRMB的熒光強(qiáng)度,不利于猝滅反應(yīng)的進(jìn)行;當(dāng)pH>3.5時,熒光猝滅基本完全;當(dāng)pH>4.0時,BRMB的熒光強(qiáng)度較大,并且熒光強(qiáng)度差值ΔF趨于恒定;當(dāng)pH>6.8時,Fe(OH)2的生成導(dǎo)致Fe2+催化性能降低。為防止Fe2+水解,試驗(yàn)選擇酸度為pH 4.2的冰乙酸-乙酸鈉緩沖液作為猝滅反應(yīng)的介質(zhì)。

2.2.4 熒光猝滅反應(yīng)時間

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1的混合溶液中,考察了熒光猝滅反應(yīng)時間對體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明,受Fe2+催化影響,H2O2氧化BRMB速率較快,熒光強(qiáng)度在5 min內(nèi)快速下降,20 min后降到最低并趨于恒定。因此,試驗(yàn)選擇的熒光猝滅反應(yīng)時間為20 min。

2.2.5 Fe2+濃度

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1的混合溶液中,改變Fe2+濃度,測定體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明：當(dāng)無Fe2+時,BRMB與H2O2不反應(yīng),熒光強(qiáng)度無變化;當(dāng)Fe2+濃度不大于80.0 μmol·L-1時,熒光強(qiáng)度顯著變小,并且Fe2+濃度越大,熒光猝滅越明顯;當(dāng)Fe2+濃度大于80.0 μmol·L-1時,熒光強(qiáng)度趨于恒定。因此,試驗(yàn)選擇的熒光猝滅反應(yīng)催化劑Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1。

2.3 酶促反應(yīng)條件的選擇

2.3.1 H2O2濃度

以酶空白體系為考察對象,在BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1,體系酸度為pH 4.2的混合溶液中,改變H2O2濃度,測定體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：當(dāng)H2O2濃度在0.05 mmol·L-1以內(nèi)時,熒光猝滅現(xiàn)象明顯,且熒光強(qiáng)度隨H2O2濃度的增大而減小;當(dāng)H2O2濃度大于0.05 mmol·L-1時,熒光強(qiáng)度趨于恒定。為拓寬酶活性測定范圍,減少系統(tǒng)誤差,試驗(yàn)選擇酶促反應(yīng)體系中底物H2O2濃度為0.05 mmol·L-1。

2.3.2 酶促反應(yīng)時間

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1,CAT活性為0.05 U·mL-1,體系酸度為pH 4.2的混合溶液中,改變酶促反應(yīng)時間,測定體系的熒光強(qiáng)度差值ΔF。結(jié)果表明,酶促反應(yīng)速率較快,12 min后ΔF值趨于恒定。為確保酶促反應(yīng)更完全,試驗(yàn)選擇的酶促反應(yīng)時間為15 min。

2.4 共存物質(zhì)的影響

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在H2O2濃度為0.05 mmol·L-1,BRMB濃度為1.4 μmol·L-1,Fe2+濃度為80.0 μmol·L-1,體系酸度為pH 4.2的混合溶液中加入適量的CAT標(biāo)準(zhǔn)溶液,使其活性分別為0,0.005,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 U·mL-1,測定體系的ΔF值。以CAT活性為橫坐標(biāo),對應(yīng)的ΔF值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：CAT標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.005～0.05 U·mL-1,線性回歸方程為y=1 205x-1.476,相關(guān)系數(shù)為0.997 4。

平行測定酶空白體系10次,以3s/k(s為標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為線性回歸方程的斜率)計算檢出限,結(jié)果為1.2×10-3U·mL-1,優(yōu)于紫外分光光度法的[6-7]。

2.6 樣品分析和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對6份血清CAT活性進(jìn)行測定(血清由體檢中心提供,屬于健康個體),計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),并與碘量法[13]作比較,然后按照標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行回收試驗(yàn),計算回收率,結(jié)果見表1。

表1 樣品分析和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

結(jié)果表明：血清CAT活性測定值為31.50～72.30 U·mL-1,與碘量法基本一致;正常人的血清CAT活性與年齡有相關(guān)性,青少年的明顯高于中老年的;加標(biāo)回收率和RSD進(jìn)一步證明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和較高的精密度。

本工作利用H2O2-Fe2+可以快速使BRMB發(fā)生熒光猝滅,而CAT對該猝滅有抑制效應(yīng),提出了基于H2O2-BRMB-Fe2+體系的熒光猝滅法測定血清CAT活性的方法。H2O2-BRMB-Fe2+熒光猝滅體系屬于動態(tài)猝滅,反應(yīng)更為完全徹底,直接用于血清CAT活性分析,無需繁雜的樣品前處理,血清自身濁度、色度不影響酶活性的測定;并且以煮死酶液為空白對照,血清中的共存還原性物質(zhì)不會對CAT造成干擾。該方法檢測范圍更寬,檢出限更低,成功用于人血清CAT活性測定,對臨床引領(lǐng)和示范作用具有重要意義。