夏雙雙,謝舒婷,陳 嵐,王蓉佳,蔡 榮*

(1.上海理工大學(xué) 材料與化學(xué)學(xué)院,上海 200093;2.上海市食品藥品包裝材料測試所,上海 201203)

藥用彈性體密封件具有密封性、化學(xué)穩(wěn)定性好以及無生理毒性等優(yōu)勢,可以保護(hù)容器內(nèi)制劑不受外部環(huán)境的影響。藥用彈性體密封件的優(yōu)良特性與其生產(chǎn)過程中加入的多種助劑(如增塑劑、填充劑、硫化促進(jìn)劑、抗氧劑等)密不可分。秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑是藥用彈性體密封件生產(chǎn)過程中所添加的一類傳統(tǒng)促進(jìn)劑,具有提高硫化速率、降低硫化溫度的作用[1]。動物毒理試驗(yàn)表明,秋蘭姆類化合物會引起動物的肺部、心臟和其他器官畸變,且會對人體皮膚和黏膜產(chǎn)生刺激。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑是一種過敏原,接觸含秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的橡膠制品會使人產(chǎn)生皮炎、濕疹等癥狀[2-4]。與其他種類包裝材料相比,藥用彈性體密封件直接與制劑產(chǎn)品接觸,容易產(chǎn)生浸出或吸附作用,從而影響制劑產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性、安全性和有效性,因此需要對于藥用彈性體密封件進(jìn)行質(zhì)量控制[5-6]。

關(guān)于秋蘭姆類化合物含量的測定方法有氣相色譜法、拉曼光譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。氣相色譜法是先將二硫化四甲基秋蘭姆(TMTD)與鹽酸反應(yīng)生成CS2,繼而采用氣相色譜儀測定CS2的含量,但該方法易造成假陽性結(jié)果[7-8]。拉曼光譜法以有序介孔碳負(fù)載Au納米顆粒作為基底,測定食品中TMTD的殘留量,該方法的優(yōu)點(diǎn)是分析時(shí)間短、靈敏度高,其不足是前處理復(fù)雜[9]。高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法也被廣泛用于TMTD的檢測[10-11]。上述方法更多是應(yīng)用在果蔬和環(huán)境中TMTD殘留量的測定,測定化合物較為單一。2018年我國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《化學(xué)藥品與彈性體密封件的相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》將藥品包裝中的TMTD列為需重點(diǎn)關(guān)注的可提取物,但目前關(guān)于測定橡膠中多種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑含量的研究方法較少。鑒于此,本工作通過優(yōu)化提取條件,提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定藥用彈性體密封件中TMTD、二硫化四乙基秋蘭姆(TETD)和二硫化四丁基秋蘭姆(TBTD)含量的方法,以期為藥用彈性體密封件中秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑含量的監(jiān)控提供技術(shù)參考。此外,文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道含仲胺、叔胺結(jié)構(gòu)的部分秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑易與空氣中或配合劑中的氮氧化合物反應(yīng)生成可致癌的N-亞硝胺類化合物。針對這一情況,本工作模擬在酸性條件下,將上述3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑與亞硝酸鹽反應(yīng),分析反應(yīng)產(chǎn)物中是否存在N-亞硝胺類化合物,從而對其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1290 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀;6470型三重四極桿質(zhì)譜儀;7890B型氣相色譜儀,配熱能分析器和Ellutia軟件;XS205DU型電子分析天平;ME204型電子分析天平;SK5910LHC型超聲波清洗機(jī);Milli-Q型超純水儀。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：取TMTD、TETD和TBTD對照品各10 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg·L-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：取TMTD、TBTD單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各3 mL及TETD單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液2 mL,用甲醇稀釋并定容至100 mL,混勻,配制成TETD質(zhì)量濃度為2 mg·L-1,TMTD和TBTD質(zhì)量濃度為3 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列：取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成TETD質(zhì)量濃度為4,10,40,100,200,300,400 μg·L-1,TMTD和TBTD質(zhì)量濃度為6,15,60,150,300,450,600 μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,于4 ℃冰箱保存。

酸性亞硝酸鈉溶液：取亞硝酸鈉40 mg,用1 mol·L-1鹽酸溶液溶解并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的酸性亞硝酸鈉溶液。

TMTD、TETD和TBTD對照品的純度均大于98%;N-亞硝基-雙異丙基胺(NDIPA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于98%;甲醇、二氯甲烷、乙腈均為色譜純;氫氧化鈉、氨水、甲酸、亞硝酸鈉、鹽酸均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Eclipsepluse C18色譜柱(50 mm×3.0 mm,1.8 μm);柱溫40 ℃;流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為甲醇;流量0.25 mL·min-1;進(jìn)樣量2 μL。梯度洗脫程序：0～10 min時(shí),A由20%升至100%,保持3 min;13～15 min,A由100%降至20%,保持5 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI+)模式;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;噴霧壓力310.26 kPa;干燥氣溫度300 ℃,干燥氣流量5 L·min-1;鞘氣溫度300 ℃,鞘氣流量11 L·min-1;毛細(xì)管電壓4 000 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 試驗(yàn)方法

將樣品剪成小碎塊,稱取1.00 g,置于頂空瓶中,加入甲醇10 mL,匝蓋密封,于室溫超聲40 min。冷卻至室溫,用少量甲醇多次洗滌樣品后,合并提取液和洗滌液,用甲醇定容至20 mL,混勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測定。另取不含目標(biāo)物的藥用彈性體密封件,按照上述步驟制備空白提取液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

使用TETD質(zhì)量濃度為100 μg·L-1,TMTD、TBTD質(zhì)量濃度為150 μg·L-1的3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試,分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液體系為流動相時(shí)對3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑峰形和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明：與水相比,采用0.1%甲酸溶液作為水相時(shí),可減少拖尾現(xiàn)象,并且TMTD、TETD、TBTD的目標(biāo)離子響應(yīng)較強(qiáng),這是由于秋蘭姆類化合物含有氨基,呈弱堿性,在酸性條件下,經(jīng)過ESI+模式充分電離后,形成帶正電的目標(biāo)離子;與乙腈相比,采用甲醇作為有機(jī)相時(shí),3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑響應(yīng)值較高。因此,試驗(yàn)選擇以甲醇-0.1%甲酸溶液體系作為流動相。

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了0.1%甲酸溶液和甲醇體積比分別為20…80,30…70,40…60,50…50時(shí)對3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑峰形的影響。結(jié)果表明：相比于其他體積比,當(dāng)以體積比20…80的0.1%甲酸溶液和甲醇的混合溶液洗脫時(shí),目標(biāo)物峰形較好。另外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用該體積比等度洗脫時(shí),TETD和TBTD的峰形較寬,且出峰時(shí)間較晚;換用梯度洗脫后,TETD和TBTD的峰形較好,TBTD保留時(shí)間由原來的37.82 min縮短至11.66 min,且其他2種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的保留時(shí)間也稍有提前。因此,試驗(yàn)選擇以甲醇-0.1%甲酸溶液體系作為流動相梯度洗脫分離3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑,優(yōu)化后的梯度洗脫程序見1.2節(jié)。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖1。

1-TMTD;2-TETD;3-TBTD圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of the mixed standard solution

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

在ESI+和負(fù)離子(ESI-)模式下對質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的TMTD、TETD和TBTD單標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行全掃描,以選擇合適的電離方式和分子離子峰。結(jié)果表明,TMTD、TETD和TBTD均更適合在ESI+模式下檢測,這是由于3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的分子結(jié)構(gòu)中均含有氮原子,易與H+結(jié)合,極性較強(qiáng)。在ESI+模式下對其進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,得到分子離子峰;然后再對分子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,每組選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的兩個(gè)碎片離子分別作為定性離子和定量離子,并優(yōu)化碎片離子的碎裂電壓和碰撞能量,使碎片離子的響應(yīng)值達(dá)到最高。最終優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 提取條件的選擇

2.3.1 提取溶劑

由于目前關(guān)于藥用包裝彈性體密封件中秋蘭姆類以及亞硝胺類化合物相容性研究較少,對提取溶劑的設(shè)計(jì)參考了相關(guān)指導(dǎo)原則[14-15]。提取溶劑通常具有與制劑相同或者相似的理化性質(zhì),重點(diǎn)考慮酸度、極性以及溶解度等。選擇陰性膠塞作為空白基底,加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別考察了酸性提取溶劑(體積比800…200…1的水-甲醇-甲酸的混合溶液)、堿性提取溶劑(體積比800…200…1的水-甲醇-氨水的混合溶液)、乙腈(中性)、甲醇(強(qiáng)極性)和二氯甲烷(弱極性)對目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖2。

1-二氯甲烷;2-酸性提取溶劑;3-堿性提取溶劑;4-乙腈;5-甲醇圖2 提取溶劑對目標(biāo)物回收率的影響Fig.2 Effect of the extraction solvent on the recoveries of targets

由圖2可知：5種提取溶劑均可以提取3種目標(biāo)物,且回收率均在80.0%以上;其中以甲醇提取的回收率相對更高。因此,試驗(yàn)選擇以甲醇作為提取溶劑。

2.3.2 提取時(shí)間

超聲可以加速樣品中目標(biāo)物的提取過程。選擇陰性膠塞作為空白基底,加入適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,考察了提取時(shí)間分別為10,20,30,40,50 min時(shí)對目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖3。

1-TMTD;2-TETD;3-TBTD圖3 提取時(shí)間對目標(biāo)物回收率的影響Fig.3 Effect of the extraction time on the recoveries of targets

由圖3可知：3種目標(biāo)物的回收率隨著提取時(shí)間的延長逐漸升高;提取40 min時(shí),回收率較高(95.0%左右);繼續(xù)延長提取時(shí)間,雖然TMTD的回收率稍有上升,但TETD和TBTD的回收率有所降低,可能是超聲時(shí)間過長,部分目標(biāo)物被降解。因此,試驗(yàn)選擇的提取時(shí)間為40 min。

進(jìn)一步采用陽性膠塞樣品對提取條件進(jìn)行驗(yàn)證,即采用甲醇超聲提取陽性膠塞樣品兩次,每次提取40 min。結(jié)果顯示,第二次超聲提取后,提取液中未檢出目標(biāo)物,表明以甲醇為提取溶劑超聲40 min一次便可充分提取3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑,該提取方法有效。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定,以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析,線性參數(shù)見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限

在陰性樣品中添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后,按照試驗(yàn)方法進(jìn)樣分析,分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對陰性樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定6次,計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表3可知：3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的回收率為80.9%～103%,測定值的RSD為2.4%～6.3%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足相關(guān)行業(yè)對秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的檢測要求。

2.6 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對6批無菌注射劑用覆聚乙烯-四氟乙烯膜的丁基橡膠塞進(jìn)行測定,其中有3批樣品檢測出TETD,檢出量分別為2.55,2.00,1.86 mg·kg-1,TMTD和TBTD未檢出,表明藥用彈性體密封件中存在秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑的殘留污染。圖4為某一批陽性樣品的MRM色譜圖。

圖4 陽性樣品的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of the positive sample

2.7 風(fēng)險(xiǎn)評估

取TMTD、TETD、TBTD單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各10 mL,各加入1 mL 0.4 mg·mL-1酸性亞硝酸鈉溶液和9 mL水,混勻,于40 ℃水浴反應(yīng)1 h,取出,冷卻至室溫,然后加入4 mL 1 mol·L-1氫氧化鈉溶液,混勻,再加入10 mL含50 ng·mL-1NDIPA(內(nèi)標(biāo))的二氯甲烷溶液,劇烈振蕩1 min,靜置分層,取下層溶液,按照本課題組提出的氣相色譜-熱能分析器測定N-亞硝胺類化合物含量的方法[16]進(jìn)行分析,結(jié)果見圖5(a)～(c);選取2.6節(jié)檢出TETD的3批陽性樣品,每批稱取1.00 g小碎塊,加入10 mL甲醇,超聲提取40 min后,靜置至室溫,用少量甲醇多次洗滌樣品后,合并提取液和洗滌液,用甲醇定容至20 mL,按照上述方法進(jìn)行亞硝酸鹽的反應(yīng)試驗(yàn),結(jié)果見圖5(d)。

1-NDMA;2-NDIPA;3-NDEA;4-NDBA圖5 N-亞硝胺類化合物的色譜圖Fig.5 Chromatograms of N-nitrosamines

結(jié)果表明：TMTD反應(yīng)液中檢出N-亞硝基二甲胺(NDMA),檢出量為11.03 μg·L-1;TETD反應(yīng)液中檢出N-亞硝基二乙胺(NDEA),檢出量為19.76 μg·L-1;TBTD反應(yīng)液中檢出N-亞硝基二丁胺(NDBA),檢出量為8.68 μg·L-1;3批陽性樣品反應(yīng)液中均檢出NDEA,檢出量分別為0.020 1,0.019 0,0.019 6 mg·kg-1。

國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 24153-2009《橡膠及彈性體材料N-亞硝基胺的測定》規(guī)定橡膠和彈性體材料中12種N-亞硝胺類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過0.5 mg·kg-1; 歐盟委員會93/11/EEC指令Com-missionDirective93/11/EECof15March1993ConcerningtheReleaseoftheN-NitrosaminesandN-NitrosatableSubstancesfromElastomerorRubberTeatsandSoothers規(guī)定了嬰兒橡膠奶嘴及撫慰品中釋放的N-亞硝胺類化合物的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)小于0.01 mg·kg-1,N-亞硝胺類化合物的殘留量應(yīng)小于0.1 mg·kg-1。因此,檢出NDEA的3批藥用彈性體密封件不符合法規(guī)規(guī)定,即為不合格產(chǎn)品。由此可見,含TMTD、TETD、TBTD的藥用彈性體密封件產(chǎn)生N-亞硝胺類化合物的風(fēng)險(xiǎn)較高。建議企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)選用不產(chǎn)生N-亞硝胺類化合物的硫化促進(jìn)劑,如二硫化四芐基秋蘭姆、二硫化四異丁基秋蘭姆來替代TMTD、TETD、TBTD。

本工作提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定藥用彈性體密封件中可生成N-亞硝胺類化合物的TMTD、TETD、TBTD等3種秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑含量的方法,該方法前處理簡單,靈敏度高,結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確,適用于相關(guān)行業(yè)對高風(fēng)險(xiǎn)秋蘭姆類硫化促進(jìn)劑進(jìn)行篩查測定。