蘇先芝,陸 華,黎欣韻,強(qiáng)玲俠,楊 茜

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,成都 610015;2. 成都中醫(yī)藥大學(xué),成都 610015;3.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院·成都市婦女兒童中心醫(yī)院,成都 611731)

近年來,受生活節(jié)奏加快、自然環(huán)境污染等多種因素影響[1],不孕不育的發(fā)生率呈現(xiàn)快速上升趨勢[2]。中醫(yī)認(rèn)為,腎藏精,主生殖,為先天之本、生殖之源。腎充則天癸至,任通沖盛,可以孕育子嗣;反之,腎虛則胞宮難以攝精成孕而發(fā)為不孕癥。腎藏精,化為陰陽,腎虛證臨床以腎陽虧虛、腎陰虧虛和腎精不足為主。研究腎虛證型對生殖器官的影響有助于解決女性不孕問題。同時,合適的動物模型及對動物模型的準(zhǔn)確認(rèn)識對研究中醫(yī)腎虛證候及治療機(jī)制具有重要意義。子宮血管與女性生育能力關(guān)系密切,子宮內(nèi)膜血管化意味著有足夠的子宮內(nèi)膜容受性,而子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜下血流不足與妊娠率的顯著下降有關(guān)[3]。因此,本文針對目前常用的三種腎虛造模方法:反復(fù)超促排致腎精虧虛法、甲狀腺素聯(lián)合利血平灌胃致腎陰虧虛法、4 ℃羥基脲灌胃致腎陽虧虛法進(jìn)行對比性研究,觀察腎虛諸證對雌性大鼠子宮血管灌注的影響,為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。本研究已通過成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查,批件編號:2021DL-002。

1 材料

1.1 動物

50只SPF級雌性SD大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量180～220 g,購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司,動物許可證號:SCXK(川)2020-030。動物飼喂于成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心,環(huán)境通風(fēng)良好,溫度20～24 ℃,相對濕度40%～79%,光照周期為12 h明/12 h暗,動物自由攝食攝水。

1.2 藥物

復(fù)方利血平片,批號:201066,國藥準(zhǔn)字:H14023613,購自亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;甲狀腺片,批號:200803,規(guī)格:40 mg,國藥準(zhǔn)字:H37020075,購自山東省惠諾藥業(yè)有限公司;注射用絨促性素(human choionic gonadotophin,HCG),批號:201203,規(guī)格:2 000單位,國藥準(zhǔn)字:H44020673,購自麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠;羥基脲片,批號:0E0413005,規(guī)格:0.5 g,國藥準(zhǔn)字:H37021289,由齊魯制藥有限公司提供。

1.3 主要試劑

孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)購自北京索萊寶科技有限公司,貨號:20210329;大鼠血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)ELISA試劑盒(貨號:MM-70867R1)、抗謬?yán)展芗に?follicle-stimulating hormone,AMH)ELISA試劑盒(貨號:MM-0575R11)、雌二醇(estrogen,E2)ELISA試劑盒(貨號:MM-0551R)、孕酮(progesterone,P)ELISA試劑盒(貨號:MM-0219R1),均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司;硫酸鋇粉末購自德國Sachleben公司,貨號:7727-43-7;醫(yī)用明膠購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,貨號:9000-70-8。

1.4 主要儀器

Skyscan 1276 X射線顯微斷層成像儀,德國Bruker公司;95-1恒溫磁力攪拌器,上海安亭電子儀器廠;TH212智能數(shù)字測溫儀,北京鴻鷗成運(yùn)儀器設(shè)備有限公司;RT-6100酶標(biāo)分析儀,深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

2 方法

2.1 分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后,每日早8:00起進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢測,連續(xù)1周光鏡下觀察,篩選出有規(guī)律動情周期的健康雌性大鼠48只進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:對照組、腎精虧虛組、腎陰虛組、腎陽虛組,每組12只。

2.2 腎虛三證大鼠模型的建立與取材

干預(yù)當(dāng)天設(shè)為0 d,對照組大鼠予2 mL 0.9 %氯化鈉溶液每日灌胃,連續(xù)21日;腎精虧虛組大鼠于0 d下午4時腹腔注射PMSG 40 IU/200 g,48 h后腹腔注射HCG 40 IU/200 g,間隔72 h重復(fù)1次,連續(xù)5次;腎陰虛組大鼠予甲狀腺片和利血平灌胃,每日灌胃劑量分別為150 mg/kg與0.25 mg/kg,連續(xù)21日;腎陽虛組大鼠予4 ℃羥基脲混懸液以350 mg/kg劑量灌胃,連續(xù)21日。第22日起各組停止造模及給藥,觀察15日。36 d起將處于動情后期的大鼠麻醉后取材并處死,無動情周期大鼠選擇非動情期取材。每組隨機(jī)選取4只進(jìn)行血管灌注,備微計(jì)算機(jī)斷層掃描(microcomputed tomography,Micro-CT)檢測,剩余大鼠腹主動脈取血并處死,取大鼠子宮,0.9%氯化鈉溶液清洗后擦干、稱重,置于4%多聚甲醛中固定。

2.3 觀測指標(biāo)

2.3.1 大鼠一般狀況觀察 觀察并記錄大鼠皮毛、活動情況、大小便和體質(zhì)量等改變。自0 d起,每日晨8:00進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片,觀察動情周期,每3日測量肛溫。

2.3.2 腎虛表征采集及檢測 每2周觀察并記錄1次宏觀表征,并根據(jù)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語證候部分》[4],結(jié)合文獻(xiàn)擬定腎虛癥狀、體征量化評分表進(jìn)行評分[5],見表 1。

表1 大鼠腎虛表征采集量表

2.3.3 大鼠血液指標(biāo)檢測 血液標(biāo)本離心后取上清液,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作,ELISA法測定血清FSH、AMH、E2、P水平。

2.3.4 子宮組織形態(tài)學(xué)觀察 稱重后將子宮分組浸入4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟切片與蘇木精-伊紅 ( hematoxylin-eosin staining, HE )法染色,光學(xué)顯微鏡下閱片,測量子宮內(nèi)膜厚度、計(jì)數(shù)腺體數(shù)。

2.3.5 子宮血管灌注 參照文獻(xiàn)方法制備硫酸鋇-明膠混合對比劑[6]:將0.9 %氯化鈉溶液、硫酸鋇粉末、醫(yī)用明膠按照20∶5∶1混合,置于37 ℃恒溫磁力攪拌器中持續(xù)攪拌,直到約2 h后明膠完全溶解且均勻混合。大鼠麻醉后開腹,暴露腹主動脈,絲線結(jié)扎腹主動脈近心端,使用眼科剪由遠(yuǎn)心端在血管壁上剪一“V”形小口,將動脈套管尖端緊貼血管壁置入腹主動脈內(nèi),均勻壓力灌注入37 ℃肝素溶液進(jìn)行沖管,當(dāng)血管內(nèi)流動液體清亮,且推注過程無明顯阻力增加,即代表沖管成功。沖管成功后灌注37 ℃硫酸鋇-明膠混合對比劑,待子宮、腸壁血管完全呈白色后,即代表灌注成功,可停止操作。將灌注后的大鼠置于4 ℃冰箱中過夜,取子宮組織置于Micro-CT中,參數(shù)設(shè)定為球管電壓55 kV,球管電流200 μA,曝光517 ms,層厚為10 μm。在大鼠左側(cè)子宮距宮頸約1 cm處選取約1 cm3的興趣區(qū)(region of interest, ROI),計(jì)算ROI內(nèi)血管體積/組織體積比、各直徑血管體積百分比、各級血管數(shù)和平均直徑。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般情況及腎虛表征評分

如表2所示,各組大鼠初始體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),造模后(21 d)及造模結(jié)束后15 d(36 d),腎精虧虛組大鼠體質(zhì)量較對照組顯著升高,腎陰虛組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.01)。如圖1所示,造模期間,腎虛三證模型大鼠均出現(xiàn)動情周期逐漸紊亂,以腎精虧虛和腎陽虛組最為顯著。 3 d起腎陰虛組大鼠肛溫即出現(xiàn)顯著升高,此后持續(xù)走高至39 ℃,21 d后肛溫有所下降,但仍顯著高于對照組;6 d起腎陽虛組大鼠肛溫顯著下降,此后持續(xù)偏低,21 d后有所回升但仍較對照組低;腎精虧虛組大鼠肛溫與對照組比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后,腎精虧虛組大鼠攝食增多、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)枯槁、皮肉松軟、缺乏彈性;腎陰虛組大鼠攝食減少、煩躁易怒、大便形小色黑,小便色黃赤,分散而臥,眼鼻、陰道出血;腎陽虛組大鼠攝食減少、毛發(fā)無光澤、弓背蜷縮、四肢及尾部發(fā)涼、耳部皮膚色蒼白。

注:▲為造模干預(yù)起始日,↑為造模結(jié)束日圖1 大鼠一般狀況比較

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較

3.2 血清ELISA檢測結(jié)果

如表3所示,與對照組比較,三模型組大鼠FSH顯著升高,E2、P、AMH值均顯著下降(P<0.05),與腎精虧虛組和腎陰虛組比較,腎陽虛組大鼠AMH值降低更顯著(P<0.05)。

表3 大鼠血清ELISA檢測結(jié)果比較

3.3 大鼠子宮組織形態(tài)學(xué)變化

如圖2所示,對照組大鼠子宮內(nèi)膜組織內(nèi)可見豐富血管,腺上皮細(xì)胞核大、圓,形態(tài)無異常,腺體數(shù)目多、腺腔大。腎精虧虛組大鼠子宮內(nèi)膜變薄,肌層肌纖維排列紊亂;腎陰虛組大鼠子宮內(nèi)膜排列紊亂,皺襞明顯增多,宮腔出血,子宮內(nèi)膜腺體排列稀疏,固有層間質(zhì)內(nèi)存在炎性細(xì)胞浸潤;腎陽虛組大鼠子宮內(nèi)膜薄,腺體減少。如表4所示,與對照組比較,腎精虧虛組與腎陽虛組大鼠子宮內(nèi)膜厚度均明顯降低(P<0.05),子宮內(nèi)膜腺體數(shù)顯著減少(P<0.01);腎陰虛組大鼠子宮內(nèi)膜厚度與子宮內(nèi)膜腺體數(shù)雖較對照組有所降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A.對照組; B.腎精虧虛組; C.腎陰虛組; D.腎陽虛組圖2 各組大鼠子宮HE染色結(jié)果(×40)

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度與腺體數(shù)比較

3.4 大鼠子宮血管構(gòu)筑結(jié)果

3.4.1 血管體積/組織體積比及各直徑血管體積百分比 各組大鼠子宮血管三維重建見圖3。如圖4所示,與對照組比較,腎虛三證模型組大鼠血管體積占比均下降(P<0.05),以腎陰虛組最為顯著(P<0.01);腎精虧虛組大鼠子宮組織<0.05 mm直徑血管體積百分比顯著下降(P<0.01);腎陰虛組大鼠<0.05 mm和0.05～0.10 mm直徑血管體積百分比升高(P<0.01),而>0.10 mm直徑血管體積百分比顯著下降(P<0.01);腎陽虛組大鼠<0.05 mm直徑血管體積百分比顯著升高(P<0.01),而>0.10 mm直徑血管體積百分比顯著下降(P<0.05)。

A.對照組; B.腎精虧虛組; C.腎陰虛組; D.腎陽虛組圖3 各組大鼠子宮血管三維重建圖

圖4 大鼠子宮血管體積/組織體積比及各直徑血管體積百分比(n=4)

圖5 大鼠子宮各級血管平均直徑(n=4)

3.4.2 各級血管平均直徑 如圖 5所示,與對照組比較,腎陰虛組大鼠一級、二級血管平均直徑減少(P<0.05);腎陽虛組大鼠各級血管平均直徑均減少(P<0.05);腎精虧虛組大鼠各級血管平均直徑差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.4.3 各級血管數(shù) 如圖6所示,與對照組比較,腎精虧虛組二、三、四級血管數(shù)均顯著減少(P<0.01);腎陰虛組二、三、四級血管數(shù)亦顯著減少(P<0.05);腎陽虛組各級血管數(shù)差異均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖6 大鼠子宮各級血管數(shù)(n=4)

4 討論

容受性高的子宮內(nèi)膜是胚胎種植成功的必要條件之一,子宮內(nèi)膜在雌孕激素的作用下發(fā)生一系列形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,包括內(nèi)膜增厚、腺體增生、血液供應(yīng)增加等,構(gòu)成良好的著床微環(huán)境,胚泡才能夠順利著床[7]。證候是中醫(yī)藥理論體系的核心部分,能夠反映疾病過程中某一階段的病機(jī),是對當(dāng)前疾病狀態(tài)的總結(jié)[8]。腎虛在中醫(yī)學(xué)中被認(rèn)為是不孕不育的常見原因,故中醫(yī)腎虛證候動物模型對研究中藥提高子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制具有重要意義。腎主生殖,藏先后天之精,腎精化生腎氣,主一身之陰陽,為天癸之源,腎氣盛實(shí)方能攝納胚胎[9]。腎氣的強(qiáng)盛與否主要取決于兩方面:一是腎精素稟是否充盛,二是腎精內(nèi)部陰陽是否協(xié)調(diào)平衡[10]。因此腎虛者通常表現(xiàn)為腎精、腎陰或腎陽的虛衰。建立不同類型的腎虛證動物模型,觀察其對生殖系統(tǒng)的影響,能夠解析不孕癥發(fā)生的生理病理機(jī)制并有助于預(yù)防和治療藥物的研發(fā)[11]。本文選取了目前應(yīng)用較多也較具代表性的三種腎虛造模方法(反復(fù)超促排法[12]、甲狀腺素聯(lián)合利血平灌胃法[13]、冰羥基脲灌胃法[14]),以腎精虧虛、腎陰虛、腎陽虛證作為研究對象,觀察此腎虛三證對大鼠生殖及子宮血管構(gòu)筑的影響。

“腎主藏精”是中醫(yī)藏象理論的重要內(nèi)容之一,腎中所藏先天之精為腎主生殖的基礎(chǔ)?！熬础?腎精虛損必然導(dǎo)致血液化生不足。有研究認(rèn)為,促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)可能是腎精的物質(zhì)基礎(chǔ)[15],表明腎精虧虛很可能導(dǎo)致生殖相關(guān)血管及血供的改變。外源性激素誘導(dǎo)反復(fù)超促排卵廣泛用于輔助生殖技術(shù),研究表明反復(fù)超促排卵會影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量[16]。本團(tuán)隊(duì)前期采用PMSG聯(lián)合HCG反復(fù)超促排卵的方法成功構(gòu)建了腎精虧虛型生育力低下的雌鼠模型[17]。本研究發(fā)現(xiàn),腎精虧虛組大鼠腎虛證候評分顯著升高,90 %以上大鼠出現(xiàn)動情周期紊亂,FSH升高,AMH、E2、P顯著降低,子宮內(nèi)膜厚度減小,腺體數(shù)減少,表明該造模法同時造成了子宮內(nèi)膜容受性的改變。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腎精虧虛組大鼠子宮血管構(gòu)筑也發(fā)生了變化,這種變化主要表現(xiàn)在血管占比減少和二、三、四級血管數(shù)量減少,而并未對各級血管直徑產(chǎn)生影響。

腎陰虛指因腎陰虧損、失于滋養(yǎng)、虛熱內(nèi)生而表現(xiàn)出的證候[18],研究表明腎陰虛患者微血管數(shù)增多,可能為其原發(fā)病不良預(yù)后的原因之一[19]。甲狀腺素聯(lián)合利血平造?？赡M體溫升高、多汗等類似腎陰虛的現(xiàn)象[20],是目前腎陰虛證應(yīng)用最廣的造模方法[21]。本研究中,腎陰虛組大鼠出現(xiàn)了煩躁易怒、消瘦、便干溲赤、陰道出血、肛溫升高等改變,同時大鼠出現(xiàn)動情周期紊亂,FSH升高,AMH、E2、P降低,子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)發(fā)生變化,表明該造模方法除引起腎陰虛表征證候改變外,還造成了雌鼠生殖系統(tǒng)的功能異常。本研究中腎陰虛組大鼠子宮一、二級大血管管徑減少、二級血管數(shù)量減少,微血管體積占比相對增大而數(shù)量減少,提示終末微血管管徑較正常增粗,子宮組織血供減少而毛細(xì)血管擴(kuò)張,引起子宮出血。

腎中陽氣具有溫煦、推動、蒸騰、氣化的作用,“諸寒收引,皆屬于腎”(《素問·至真要大論篇》),若腎陽不足,陰寒內(nèi)盛,筋脈收引而攣急,血絡(luò)凝滯不暢,則會引起血管收縮而使組織器官血供不足。羥基脲可抑制核苷酸的代謝與DNA的合成,模擬下丘腦-垂體-靶腺軸受抑制的病理狀態(tài),使動物表現(xiàn)出毛發(fā)枯槁、精神萎靡,蜷縮、消瘦等“腎陽虛”的癥狀[22],冰羥基脲灌胃法是本課題組在前期研究基礎(chǔ)上優(yōu)化后的腎陽虛造模方法,可以更敏銳地建立腎陽虛證不孕的動物模型[14, 23]。本研究中,腎陽虛組大鼠出現(xiàn)弓背蜷縮、肛溫下降、動情周期紊亂等腎陽虛證候,血清FSH顯著升高,AMH、E2、P顯著降低,子宮內(nèi)膜變薄,腺體數(shù)顯著下降,表明該造模方法引起了雌性大鼠生殖系統(tǒng)的顯著改變,與前期結(jié)果一致[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)該腎陽虛不孕雌鼠模型子宮大血管體積占比顯著下降,各級血管數(shù)量未有顯著變化而直徑均顯著下降。腎陽不足則虛寒內(nèi)生,腎陽的溫煦、推動作用減弱,且寒主收引,故出現(xiàn)各級血管管徑減小,子宮組織血供減少可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜變薄、腺體減少,致使胞宮難以攝精成孕。

腎中精氣可化生血液,以灌充血脈,氣血為人體陰陽之基礎(chǔ)[24]。《素問·奇病論篇》曰“胞絡(luò)者系于腎”。胞脈即為胞宮的血脈,胞絡(luò)實(shí)際是胞宮上的脈絡(luò),是腎中精氣輸注于胞宮的道路[25]。胞宮、胞脈、胞絡(luò)正常運(yùn)行并且相互作用,才能使子宮內(nèi)膜易于受胎。若胞絡(luò)失暢、胞脈不充,則胞宮失司難以攝精成孕。本研究中,三種腎虛模型大鼠均表現(xiàn)出腎虛證候,出現(xiàn)血清性激素改變、動情周期紊亂等,表明腎精、腎陰或腎陽任一的虛損均可導(dǎo)致卵巢功能的下降。但子宮組織形態(tài)學(xué)卻產(chǎn)生了不同的改變,腎精虧虛證大鼠子宮內(nèi)膜腺體減少,血管數(shù)量減少;腎陰虛證大鼠子宮出血,大血管管徑減小而微血管增粗;腎陽虛證大鼠子宮內(nèi)膜變薄,各級血管管徑減小。本研究結(jié)果表明子宮血管的變化可能是雌鼠生殖功能、子宮內(nèi)膜容受性下降的原因之一,可為中醫(yī)藥“同病異治”及改善不同證型的子宮血管血供提供研究基礎(chǔ)。