張梅芳 石 建 呂 軍 薛 剛△

(1.江蘇省如皋市中醫(yī)院藥劑科,江蘇 如皋 226500;2.江蘇省如皋市中醫(yī)院內(nèi)科,江蘇 如皋 226500)

胃癌不但是我國也是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,中老年人群是胃癌的主要發(fā)病群體,但隨著人們生活環(huán)境、飲食習(xí)慣的變化,近年來胃癌的發(fā)生率呈年輕化趨勢[1-3]。目前治療胃癌的主要手段為手術(shù)結(jié)合術(shù)后化療,但化療后的毒副作用明顯,大多數(shù)患者無法耐受。近年來,中醫(yī)藥在治療胃癌方面療效確切,尤其在減輕化療毒副作用、改善患者生活質(zhì)量方面效果顯著[4-5]。卷柏科卷柏屬江南卷柏,含有豐富的黃酮類成分,其中含量較大的主要為雙黃酮類,穗花杉雙黃酮(amentoflavone,AMF)就是從中提取的一種雙黃酮類單體,研究表明AMF具有很好的抗癌活性[6],可抑制卵巢癌細胞遷移[7],促進肺腺癌細胞凋亡[8]等。我們前期研究也顯示,AMF能有效抑制人胃癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[9]。為進一步研究AMF的抗癌作用,本實驗繼續(xù)以人胃癌細胞為目標(biāo)觀察AMF對人胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 藥物及細胞株 AMF,分子式為C30H18O10,購自中國藥品生物制品檢定所,用二甲基亞砜(DMSO)溶解,4 ℃保存,臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度;BGC-823人胃癌細胞株,購自中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。

1.1.2 試劑 1640培養(yǎng)液(含小牛血清、雙抗)購自美國Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)購買自Biosharp公司;基質(zhì)膠Matrigel、纖維粘連蛋白(FN)膠購自美國BD公司;Transwell侵襲小室購自美國Millipore公司;蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)抗體：β-actin一抗購自美國Sigma公司,基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)蛋白(RECK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)一抗購自美國Cell Signaling公司,山羊抗鼠、抗兔二抗購自北京中杉生物技術(shù)公司,其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 MTT細胞增殖試驗 將BGC-823人胃癌細胞接種于96孔板,每孔8×103,待細胞貼壁后,實驗組分別加入含AMF濃度為400、200、100、50 μmol/L的1640培養(yǎng)液干預(yù),另設(shè)含1‰DMSO的對照及不加任何藥物的1640培養(yǎng)液對照,培養(yǎng)24 h后,向96孔板中每孔加入MTT染色,繼續(xù)培育4 h,用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處吸光值,通過公式：(1-實驗組/對照組)×100%,計算AMF對BGC-823人胃癌細胞增殖的抑制率,試驗重復(fù)3次,取3次結(jié)果平均值,繪制成柱狀圖。

1.2.2 Transwell侵襲試驗 將BGC-823人胃癌細胞接種于直徑為10 cm培養(yǎng)皿,饑餓細胞24 h后,消化細胞,事先將Matrigel膠稀釋(與去離子水1∶9),平鋪于每個Transwell小室底部,隨后將5×105/100 μL BGC-823人胃癌細胞接種于小室中,小室置于24孔板中,上室為含1%血清培養(yǎng)液,下室為含10%血清培養(yǎng)液,按照預(yù)設(shè)的不同濃度AMF(依次為400、200、100 μmol/L)給藥,空白對照組不給藥,24 h后結(jié)晶紫染色,取下Transwell小室基底膜,于倒置顯微鏡下(×400)拍照,分析各組差異。

1.2.3 細胞劃痕試驗 將BGC-823人胃癌細胞接種于24孔板,每孔1×106,放至孵箱,待細胞貼壁后,用槍頭在每孔中劃3道痕,洗掉不再貼壁的細胞,空白對照組不加任何藥物,試驗組分別加入含不同濃度AMF(依次為400、200、100 μmol/L)的,培養(yǎng)24 h后,棄上清,于倒置顯微鏡下(×100),拍照,分析各組差異。

1.2.4 細胞粘附試驗 將BGC-823人胃癌細胞接種于直徑為10 cm培養(yǎng)皿,按照預(yù)設(shè)的含不同濃度AMF(依次為400、200、100 μmol/L)的1640培養(yǎng)液培養(yǎng),空白對照組1640培養(yǎng)液不加任何藥物,24 h后消化細胞,離心,用原含藥培養(yǎng)液重懸細胞沉淀,事先將FN膠稀釋至濃度0.1 mg/mL,平鋪于96孔板,隨后96孔板中每孔接種1×105個細胞,每隔20 min吸棄原含藥培養(yǎng)液,加入不含任何藥物的1640培養(yǎng)液,至80 min時,吸棄每個孔中的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,MTT染色,將96孔板于酶標(biāo)儀上測490 nm波長吸收值,所得數(shù)據(jù)進行分析差異。

1.2.5 Western bolt實驗 采用Western bol法檢測與侵襲、遷移、粘附相關(guān)的RECK、MMP-2、MMP-9蛋白及PI3K/Akt通路相關(guān)的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達情況。將BGC-823細胞接種于直徑為10 cm培養(yǎng)皿,按照預(yù)設(shè)的含不同濃度AMF(依次為400、200、100 μmol/L)的1640培養(yǎng)液培養(yǎng),空白對照組1640培養(yǎng)液不加任何藥物,24 h后,提取各組濃度相關(guān)蛋白,隨后用Western bolt法進行蛋白濃度測定,最后得出Western bolt條帶。

2 結(jié)果

2.1 各組BGC-823細胞增殖抑制率比較 50、100、200、400 μmol/L濃度的AMF對BGC-823細胞增殖均有抑制作用,抑制率分別為(17.63±2.9)%、(38.16±3.8)%、(61.44±5.3)%、(83.71±4.2)%,與1‰DMSO組及空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨AMF濃度增加抑制率逐漸升高(P<0.05),呈現(xiàn)濃度依賴性關(guān)系。見圖1。

圖1 各組BGC-823細胞增殖抑制率比較*P<0.05

2.2 Transwell侵襲試驗結(jié)果 鏡下觀察顯示,空白對照組Transwell小室基底膜上細胞輪廓清晰、活力旺盛,而各試驗組Transwell小室基底膜上細胞變圓、稀疏。與空白對照組相比,100、200、400 μmol/L濃度AMF組侵襲過去的細胞數(shù)目均明顯低于空白對照組(P<0.05),且隨著AMF濃度的增加侵襲細胞數(shù)逐漸減少(P<0.05),呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。見圖2、表1。

表1 Transwell侵襲試驗隨機5個視野下的穿膜細胞數(shù) 個

圖2 Transwell侵襲試驗隨機視野下穿膜細胞圖(×400)

2.3 細胞劃痕試驗結(jié)果 與空白對照組相比,AMF 100、200、400 μmol/L濃度遷移至劃痕區(qū)域內(nèi)的BGC-823細胞數(shù)目均少于空白對照組(P<0.05),且隨著AMF濃度增加遷移細胞數(shù)目逐漸減少(P<0.05),呈濃度依賴關(guān)系。見圖3。

注：兩側(cè)黑線內(nèi)為遷移過去的細胞

2.4 細胞粘附試驗結(jié)果 100、200、400 μmol/L濃度的AMF作用于BGC-823細胞20、40、60、80 min后,各濃度組在各時間點粘附于FN膠上的細胞數(shù)均低于空白對照組(P<0.05),且隨著AMF濃度的增加,細胞粘附抑制率越大,隨著作用時間的增加,細胞粘附抑制率亦越大(P<0.05),呈濃度、時間依賴關(guān)系。見圖4。

圖4 細胞粘附試驗結(jié)果

2.5 Western bolt實驗

2.5.1 各組RECK、MMP-2及MMP-9蛋白表達比較 與空白對照組比較,AMF 100、200、400 μmol/L組RECK蛋白表達量均高于空白對照組(P<0.05),MMP-2及MMP-9蛋白表達量均低于空白對照組(P<0.05),且隨著AMF濃度的增加RECK蛋白表達量明顯增高,MMP-2及MMP-9蛋白表達量明顯降低(P<0.05),呈濃度依賴關(guān)系。見圖5。

圖5 各組RECK、MMP-2及MMP-9蛋白條帶圖

2.5.2 各組PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白表達比較 與空白對照組比較,AMF 100、200、400 μmol/L組的p-Akt及p-PI3K蛋白表達量均低于空白對照組(P<0.05),且隨AMF濃度的增加表達量明顯降低(P<0.05),呈濃度依賴關(guān)系。但各組間PI3K及Akt蛋白表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 各組PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白條帶圖

3 討論

惡性腫瘤除了可以不受限制的增殖外,侵襲和遷移是其臨床典型的特征,可導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散,嚴(yán)重威脅患者的生命健康。惡性腫瘤轉(zhuǎn)移擴散的本質(zhì)即是腫瘤細胞通過血液或淋巴管,脫離原發(fā)病灶,侵潤周圍靶器官,或遷移至遠處正常組織中,形成新的腫瘤病灶,這是一個多因子參與的復(fù)雜過程[10]。MMP家族是一類蛋白水解酶,幾乎可以降解細胞外基質(zhì)內(nèi)的任何一種成分,在腫瘤轉(zhuǎn)移擴散中發(fā)揮著重要的作用[11-12]。MMP-2及MMP-9是MMP家族的主要成員,研究表明基底膜是上皮腫瘤細胞侵襲、遷移過程中的第一道屏障,其主要成分包括基底膜膠原、纖連蛋白、彈性蛋白,而MMP-2及MMP-9能夠通過降解基質(zhì)和基底膜的活性,增強腫瘤細胞的侵襲能力[13-15]。因此,MMP-2及MMP-9的表達情況可以反映出惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力,對于評估患者的預(yù)后具有重要意義。RECK是MMP的抑制劑,可以通過抑制MMP家族蛋白如MMP-2、MMP-9的表達而抑制惡性腫瘤的侵襲[16-17]。大量研究發(fā)現(xiàn),在惡性腫瘤細胞株中,RECK蛋白一般低表達,但若通過一定手段使惡性腫瘤細胞中RECK表達增加時,相對應(yīng)惡性腫瘤細胞中MMP-2、MMP-9的表達含量則會減低,腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移性也隨之降低[18]。

PI3K/Akt信號通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著極其重要作用[19]。Akt是PI3K的下游效應(yīng)分子,PI3K通過p-Akt來激活其生物學(xué)活性,激活后可影響多種與腫瘤細胞生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達,如MMP家族蛋白,促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[20-21]。因此,抑制PI3K/Akt信號通路活化,能有效抑制腫瘤進程,遏制其進一步發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移。

基于此,我們以PI3K/Akt信號通路為切入點,探索AMF能否抑制PI3K/Akt的磷酸化水平,并通過MTT細胞增殖試驗、Transwell侵襲試驗、細胞劃痕試驗及細胞粘附試驗觀察AMF對BGC-823人胃癌細胞增殖、侵襲、遷移、粘附能力的影響。MTT細胞增殖試驗結(jié)果顯示,不同濃度的AMF對BGC-823細胞增殖均有抑制作用,在AMF濃度為400 μmol/L時抑制能力最強。Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示,各濃度AMF組Transwell侵襲小室中侵襲過去的細胞數(shù)目均明顯少于空白對照組,在AMF濃度400 μmol/L時其抑制侵襲能力最強。細胞劃痕試驗結(jié)果顯示,各濃度AMF組遷移到劃痕區(qū)中的細胞數(shù)目均少于空白對照組,在AMF濃度400 μmol/L時遷移到劃痕區(qū)的細胞數(shù)目最少。細胞粘附試驗結(jié)果顯示,AMF對BGC-823細胞的粘附抑制率隨著時間、濃度的增加而增加,呈時間、濃度依賴關(guān)系。最后通過Western bolt實驗觀察AMF對RECK、MMP-2及MMP-9蛋白表達的影響,以及對PI3K、Akt蛋白表達與磷酸化的影響,結(jié)果顯示不同濃度的AMF對BGC-823細胞內(nèi)MMP-2及MMP-9蛋白表達均抑制作用,對RECK蛋白表達均有促進作用,且對PI3K及Akt蛋白的磷酸化過程有抑制作用,且均呈現(xiàn)濃度依賴性,在濃度為400 μmol/L時表現(xiàn)最佳。

綜上所述,AMF能抑制BGC-823人胃癌細胞株的增殖、侵襲、遷移、粘附能力,其機制可能與促進RECK蛋白表達,下調(diào)MMP-2及MMP-9蛋白表達,并抑制PI3K及Akt蛋白磷酸化從而抑制PI3K/Akt信號通路表達有關(guān)。本試驗局限在體外腫瘤細胞上,下一步我們將從體內(nèi)動物實驗出發(fā),進一步驗證AMF的抗腫瘤機制。