楊馨,徐念智,符文鳳,張文濤,殷漢智,李兵

(廣西中醫(yī)藥大學藥學院,南寧 530200)

廣西鵝掌柴(SchefflerakwangsiensisMerr.ex Li)為五加科鵝掌柴屬植物,性味微苦、性溫,別名漢桃葉、七葉蓮、七加皮、白花鵝掌柴等,主產(chǎn)于廣西。民間多以根、皮、莖葉入藥,有祛風止痛、舒筋活絡(luò)的功能[1]?！吨腥A本草》描述該屬植物多可“祛風除濕、活血消腫。用于治療風濕痹痛,跌打腫痛,骨折,頭痛、腰痛、脘腹疼痛等多種疼痛癥”[2]。目前國內(nèi)外對廣西鵝掌柴的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制等研究較少,研究表明,其主要的化學成分主要是三萜皂苷類[3-4],另外該屬植物中還含有甾醇、長鏈烯烴、有機酸、揮發(fā)油[5-6]等成分。中藥指紋圖譜作為中藥應(yīng)用較為廣泛的質(zhì)量評價模式之一[7],采用多維多息指紋圖譜技術(shù),能全面反映中藥所包含的化學信息,但主要集中于整體相似度評價,差異性不夠突出,化學模式識別技術(shù)則強調(diào)數(shù)據(jù)之間的差異性,恰好可以彌補中藥指紋圖譜的不足,兩者結(jié)合可在整體評價的基礎(chǔ)上體現(xiàn)出差異性成分的信息[8]。筆者在本研究建立廣西鵝掌柴高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,從整體角度得到該藥材的較多化學成分信息。特征圖譜的建立為廣西鵝掌柴的應(yīng)用提供可靠的質(zhì)量標準控制方法。

1 儀器與材料

1.1儀器 島津高效液相色譜儀(LC-2030 Plus);CPA225D 型電子天平(德國賽多利斯公司,感量:0.01 mg);KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料 甲醇、乙腈為色譜級;紅景天苷對照品(批號:110818-200404)、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩釋φ掌?批號:111894-201102)、咖啡酸對照品(批號:110885-201703)均購于中國食品藥品檢定研究院;柚皮素對照品(批號:20130306,含量≥98.0%)購于廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司;水為超純水,其余試劑均為分析純。10批廣西鵝掌柴藥材均采自廣西各地區(qū),見表1,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授鑒定為五加科鵝掌柴屬植物廣西鵝掌柴(SchefflerakwangsiensisMerr.ex Li)的根、莖部分。

表1 10個產(chǎn)地廣西鵝掌柴藥材來源

表2 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴共有峰相對保留時間

表3 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴共有峰相對峰面積

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為 COSMOSIL 5C18-PAQ 柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(C)-0.1% 磷酸溶液(D),梯度洗脫(0～10 min,5%C;10～15 min,5%→15%C;15～25 min,15%→30% C;25～45 min,30%→40% C;45～70 min,40%→60%C;70～90 min,60%→75% C;90～110min,75%→100%C;110～130 min,100%C);流速為 0.7 mL·min-1,柱溫為30 ℃,檢測波長為 287 nm,進樣量為 20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取紅景天苷、4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?、咖啡酸、柚皮素對照品適量,置10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過,即得混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取10批廣西鵝掌柴樣品粉末各 2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別加入甲醇15 mL,稱定質(zhì)量,超聲(200 W,40 kHz) 提取40 min,放冷,補重,濾過,濾液經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過,即得。

2.2.3空白溶液 取甲醇溶液作為空白溶液,即得。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性實驗 為排除空白試劑干擾,取“2.2.3節(jié)”空白溶液,按 “2.1節(jié)”色譜條件進樣,結(jié)果表明甲醇溶劑對色譜峰的出峰情況沒有干擾。

2.3.2精密度實驗 取廣西鵝掌柴(S3) 粉末2 g,精密稱定,按“2.2.2節(jié)”方法制備供試品溶液。按 “2.1節(jié)”下色譜條件連續(xù)進樣6次,以18號柚皮素色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值,結(jié)果均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.3重復性實驗 取同一批廣西鵝掌柴粉末(S3) 6份,每份約2 g,精密稱定,按“2.2.2節(jié)”方法制備供試品溶液,按“2.1節(jié)”色譜條件進樣測定,以18號柚皮素色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值,結(jié)果顯示均小于3.0%,表明該方法重復性良好。

2.3.4穩(wěn)定性實驗 取同一批廣西鵝掌柴粉末 (S3)2 g,精密稱定,按“2.2.2節(jié)”方法制備供試品溶液,按“2.1節(jié)”色譜條件,分別在0、4、8、12、16、24 h 進樣,以18號柚皮素色譜峰為參照峰(S),計算各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值,結(jié)果顯示均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4HPLC指紋圖譜的建立及共有峰的指認 取10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴,按“2.2.2節(jié)”方法制備樣品溶液,進樣測定,將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 版)”,以S3號樣品圖譜為參照,中位數(shù)法生成對照圖譜,設(shè)定時間窗寬度為0.1,進行圖譜匹配,得到 HPLC 指紋圖譜疊加圖及生成的對照圖譜(圖1、圖2),共標定有22個共有峰。通過與對照品色譜圖(圖3) 比對,確定1號為紅景天苷、13號為4,5-二-O-咖啡?？鼘幩帷?4號為咖啡酸、18 號為柚皮素。以18號柚皮素色譜峰為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間與相對峰面積,結(jié)果見表1～3。各共有峰相對保留時間的RSD數(shù)值為0.006%～0.15%,表明不同產(chǎn)地藥材共有峰出峰時間較穩(wěn)定,而相對峰面積的RSD數(shù)值為1.36%～33.42%,說明不同產(chǎn)地藥材指紋圖譜中的色譜峰之間的相對峰面積不同,各化學成分含量有一定差異。10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴樣品指紋圖譜相似度評價結(jié)果見表4,各產(chǎn)地樣品的相似度在0.922～0.999,表明各產(chǎn)地藥材的質(zhì)量相對穩(wěn)定,其化學成分基本一致。

圖1 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴色譜峰圖

圖2 廣西鵝掌柴對照指紋共有模式圖

1.紅景天苷;13.4,5-二-O-咖啡?？鼘幩?14.咖啡酸;18.柚皮素。

表4 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴指紋相似度結(jié)果

2.5聚類分析(cluster analysis,CA) 采用SPSS 24.0版軟件,以10個廣西鵝掌柴樣品的22個共有峰峰面積為變量,采用組間聯(lián)接,平方Euclidean 距離作為度量標準,進行聚類分析,結(jié)果見圖4。當歐氏距離約為12時,樣品分成4類,S4、S5、S6、S7 號樣品為一類;S9號樣品為一類;S1、S2號樣品為一類;S3、S8、S10為一類。聚類分析發(fā)現(xiàn),10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴存在一定的差異,該差異可能與采集地點、采集時間、氣候等外界因素有一定的關(guān)系,其具體差異性原因有待進一步分析。

圖4 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴樣品聚類分析圖

2.6主成分分析(principal component analysis,PCA) 以廣西鵝掌柴22個共有峰面積為變量,采用SPSS 24.0版軟件進行主成分分析,計算其特征值和方差貢獻率,以特征值>1為標準,得到4個主成分,其累計方差貢獻率為95.39%,結(jié)果見表5,累計方差貢獻率較全面地體現(xiàn)出廣西鵝掌柴化學成分的基本特征。結(jié)合樣品PCA碎石圖(圖5)分析,圖中的曲線自第5個主成分開始存在1個明顯的拐點,而剩余其他成分的斜率相對較平緩,表明提取前4個主成分進行分析較為適宜。

圖5 廣西鵝掌柴主成分分析碎石圖

表5 廣西鵝掌柴主成分分析特征值和方差貢獻率

用SPSS 24.0版軟件進行因子分析時,得到的是因子載荷矩陣,見表6,主成分的貢獻大小取決于載荷的絕對值大小。由表6可知,峰7、8、9、11、12、14、15、18、19、20、21在主成分1 有較高的載荷,峰2、6在主成分2有較高的載荷,說明以上各色譜峰對該廣西鵝掌柴的質(zhì)量貢獻較大。提示可將其作為廣西鵝掌柴的質(zhì)量控制指標性成分。計算主成分得分時,需要用未旋轉(zhuǎn)的因子載荷矩陣的系數(shù)除以對應(yīng)成分特征根的平方根作為指標的系數(shù)權(quán)重,即特征向量。特征向量U由因子載荷矩陣A以及特征值λ計算而來,即Ui=(Ai/λi)1/2,求得特征向量[9],結(jié)果見表7。

表6 廣西鵝掌柴主成分分析因子載荷矩陣

表7 廣西鵝掌柴主成分分析特征向量

以X1、X2、X3、X4 代表4個主成分作為 10 個廣西鵝掌柴樣品成分所表達的信息,以標準化的共有峰峰面積(A1～A22)為變量,建立起品質(zhì)評價模型,計算其綜合得分。X1=0.218Z1+0.163Z2+0.208Z3+0.180Z4+0.017Z5+0.122Z6+0.273Z7+0.228Z8+0.238Z9-0.056Z10+0.253Z11+0.254Z12+0.198Z13+0.257Z14+0.252Z15+0.193Z16-0.075Z17+0.251Z18+0.253Z19+0.265Z20+0.257Z21+0.213Z22;X2=-0.207Z1+0.351Z2+0.197Z3+0.118Z4+0.386Z5+0.395Z6-0.022Z7-0.156Z8+0.098Z9-0.276Z10+0.098Z11-0.122Z12-0.264Z13+0.108Z14+0.102Z15-0.322Z16-0.133Z17+0.118Z18+0.102Z19-0.108Z20-0.164Z21-0.254Z22;X3=-0.033Z1+0.230Z2+0.295Z3+0.005Z4+0.377Z5+0.252Z6-0.027Z7+0.002Z8-0.099Z9+0.474Z10-0.117Z11+0.146Z12+0.224Z13-0.128Z14-0.079Z15+0.111Z16+0.512Z17-0.132Z18-0.131Z19+0.004Z20+0.033Z21+0.008Z22;X4=-0.124Z1+0.054Z2-0.034Z3-0.53Z4-0.063Z5-0.079Z6-0.063Z7+0.317Z8-0.369Z9+0.043Z10+0.242Z11-0.079Z12+0.201Z13+0.160Z14+0.260Z15-0.116Z16+0.181Z17+0.225Z18+0.230Z19-0.108Z20-0.035Z21-0.286Z22;綜合得分X=(0.598 47X1+0.176 51X2+0.122 54X3+0.056 37X4)/0.953 88,廣西鵝掌柴成分得分及排名見表8,其中S1、S3、S8得分最高。為進一步分析10個廣西鵝掌柴樣品的組間差距,將廣西鵝掌柴22個共有峰峰面積導入SIMCA 13.0版軟件繪制 PCA 得分圖(圖6),10個廣西鵝掌柴樣品被分為四類,其中S4、S5、S6、S7 號樣品為一類;S9號樣品為一類;S1、S2號樣品為一類;S3、S8、S10為一類。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

圖6 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴PCA-X得分圖

表8 廣西鵝掌柴成分得分及排名

2.7正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA) 在PCA-X的基礎(chǔ)上,以廣西鵝掌柴22個共有峰面積為變量,采用SIMCA 13.0版軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析。結(jié)果顯示,模型解釋率參數(shù)(R2X、R2Y)分別為0.999、0.997,模型預(yù)測能力參數(shù)(Q2)為0.891,均>0.5,表明該模型較穩(wěn)定可靠。OPLS-DA得分圖見圖7,10個廣西鵝掌柴樣品被分為四類,其中S4、S5、S6、S7 號樣品為一類;S9號樣品為一類;S1、S2號樣品為一類;S3、S8、S10為一類。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。根據(jù)變量重要性投影值(variable importance in the projection,VIP)圖(圖8)可知,VIP>1 的色譜峰有4號峰(VIP=2.61)、11號峰(VIP=1.74)、5號峰(VIP=1.22)、1號峰(VIP=1.14)、2號峰(VIP=1.12)、6號峰(VIP=1.09),表明這6個共有成分可能是影響該藥材質(zhì)量差異的主要標志性成分,其產(chǎn)地的差異性可能是多個成分共同影響的結(jié)果。

圖7 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴OPLS-DA得分圖

圖8 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴20個共有峰的VIP圖

3 討論

3.1提取工藝的優(yōu)化 分別考察不同提取方式、甲醇濃度、提取時間和提取溶劑等因素,發(fā)現(xiàn)甲醇15 mL,超聲提取40 min,色譜峰的分離度和峰面積最佳,可作為該供試品溶液的制備方法。

3.2色譜條件的優(yōu)化 對不同的流動相(甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水),流速(0.6、0.7、1.0 mL·min-1),柱溫(25、30、35 ℃),進樣量(10、15、20 μL),色譜柱[COSMOSIL 5C18-PAQ 柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm)、welch XB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、UItimate LP-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)],根據(jù)色譜峰分離情況等確定上述最佳色譜條件。在比較不同色譜條件時,進行耐用性考察,各特征峰相對保留時間、相對峰面積基本一致,表明流速、進樣量、柱溫、色譜柱等在不同條件變化時,對檢測結(jié)果影響較小。

3.3指紋圖譜結(jié)合化學計量法結(jié)果分析 10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴指紋圖譜相似度為0.922～0.999,說明不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量穩(wěn)定性較高,該評價手段主要集中于整體相似度評價,差異性不夠突出。故本文結(jié)合化學計量法手段,彌補了指紋圖譜的不足,重點分析10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴色譜峰之間的差異性,聚類分析將10個樣品分成4類,主成分分析得到4個主成分,累計方差貢獻率達 95.39%,OPLS-DA分析也將10個不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴分成4類,與聚類分析結(jié)果一致,同時分析不同產(chǎn)地廣西鵝掌柴主要差異標志性的物質(zhì),指認了部分色譜峰。從本文研究結(jié)果可見,兩者評價手段的結(jié)合,既能全面地體現(xiàn)出廣西鵝掌柴化學成分的整體信息,又能通過化學計量法手段突出不同產(chǎn)地之間個體差異性,為廣西鵝掌柴的整體質(zhì)量評價提供了可靠的分析方法。