文星星，沈 萍，張 濤，李詩卉，申 童，譚勝國

湖南生物機電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙，412000

中藥研究非常關(guān)注中藥的效應(yīng)與物質(zhì)基礎(chǔ)，這也是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化要解決的關(guān)鍵問題。目前，通過應(yīng)用高效液相色譜、紫外和紅外光譜及質(zhì)譜等現(xiàn)代檢測技術(shù)，我們能夠分離并分析中藥中的各種成分。同時，結(jié)合藥理學(xué)實驗，我們可以深入研究中藥中的活性成分，以進一步揭示中藥的作用機制，這也是目前研究中藥活性成分的基本方法。然而，獲取可用于常規(guī)藥理效應(yīng)研究的化合物并不容易。因此，引入生物色譜法，即將色譜分離與分子生物技術(shù)相結(jié)合，為中藥活性成分的篩選、分離分析及其作用機理的研究提供了新的思路與方法，尤其對中藥活性成分的篩選具有重要意義，為中藥現(xiàn)代化進程提供了強有力的支持[1]。

1 基本原理和分類

1.1 生物色譜法基本原理

生物色譜法是基于生命科學(xué)和色譜技術(shù)交叉融合的一種新技術(shù)，出現(xiàn)于20 世紀80年代中后期。該技術(shù)采用活性生物大分子、生物膜或仿生生物膜、活細胞作為生物活性填料，并將其固定在液相色譜載體上，用于分離和分析藥物活性成分。這種系統(tǒng)可以模擬藥物中的活性成分與生物大分子、靶標或細胞之間的相互作用，可以應(yīng)用于活性成分的篩選與分離及藥物中活性成分作用機制的研究。生物色譜法具有獨特的優(yōu)點，展現(xiàn)出光明的發(fā)展前景。

1.2 生物色譜法分類

根據(jù)固定相的不同，生物色譜法可分為分子生物色譜法、生物膜或仿生生物膜色譜法和細胞生物色譜法等類別。其核心技術(shù)為將活性生物大分子或脂筏、生物膜或仿生生物膜、活細胞等作為生物活性填料，并使其與色譜載體結(jié)合作為固定相[1-2]。

2 在中藥研究中的應(yīng)用

2.1 分子生物色譜法在中藥研究中的應(yīng)用

分子生物色譜法是基于生物大分子特異性識別原理的一種生物色譜技術(shù)，主要用于分離和分析中藥及其復(fù)方中具有活性的化合物。該技術(shù)將酶、受體、DNA 及血漿轉(zhuǎn)運蛋白等作為配基來研究藥物活性成分與配基之間的相互作用。自20 世紀90年代初起，分子生物色譜法就開始被應(yīng)用于藥物活性成分與生物大分子之間相互作用的研究。其中，常見的生物大分子包括血漿蛋白、人血清白蛋白、α1-酸性糖蛋白、酶和黑色素等[3]。在技術(shù)發(fā)展方面，分子生物色譜法與核磁共振技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)等相結(jié)合建立了一體化系統(tǒng)，可以提供結(jié)構(gòu)信息，實現(xiàn)活性成分的篩選、分離分析與結(jié)構(gòu)鑒定的一體化。

分子生物色譜法是一種高效且具有強特異性的分離篩選方法，在中藥活性成分的篩選中得到了廣泛應(yīng)用。王序等[4]從現(xiàn)代分子生物學(xué)出發(fā)，首次全面探索了分子生物色譜技術(shù)在中藥活性成分研究中的應(yīng)用。其采用多種酶和受體、補體系統(tǒng)等對常用的150 種中藥中的400 多種提取物進行了生物活性篩選，找到了許多新的模式化合物，不僅為中藥作用機理的研究提供了新思路，也推動了中藥現(xiàn)代化進程。隨后，孔亮等[5]以人血清蛋白等大分子為固定相構(gòu)建了分子生物色譜體系，對當歸、川芎等中藥中的活性成分進行了篩選，并建立了對當歸中的阿魏酸和藁本內(nèi)酯的定量分析方法，推動了分子生物色譜技術(shù)的發(fā)展。潘再法等[6]以牛血清蛋白作為固定相構(gòu)建了生物色譜體系，進一步研究了當歸中的活性成分。尚叢珊[7]等建立了β2-AR 色譜模型，并應(yīng)用該模型初步驗證了黃芩等藥物中的活性成分，發(fā)現(xiàn)黃芩等中藥中含有能夠與β2-AR 發(fā)生作用的活性成分，從而論證了受體作為固定相在中藥活性成分篩選中的作用。此外，利用脂筏，即細胞膜結(jié)構(gòu)中的特殊脂質(zhì)或蛋白區(qū)域作為固定相配基的脂筏色譜也成為了研究熱點，尤其是多靶標的脂筏色譜在抗腫瘤藥物活性成分篩選中得到了廣泛應(yīng)用。余江南教授組的屈睿博士構(gòu)建了多靶點的脂筏親和色譜，并對北葶藶子中的抗腫瘤活性部分進行了提取分離，分析了其抗腫瘤活性和作用機理，實現(xiàn)了對中藥中活性成分的多靶點高效分析[8]。

2.2 生物膜色譜法在中藥研究中的應(yīng)用

生物膜色譜法是指以活性細胞膜為固定相的生物色譜技術(shù)。目前，常用的細胞種類包括血管內(nèi)皮細胞、肝細胞、心肌細胞、紅細胞、血小板、胰島β-細胞等，具有特異性、多靶標性、將分離和篩選相結(jié)合及適用于大規(guī)模藥物篩選的特點，對中藥研究具有重要意義。

賀浪沖教授首次提出了細胞膜色譜的理念，他用吸附法將活性細胞膜固定在硅膠表面，同時結(jié)合其色譜特性引入了細胞膜生物色譜法[9]，并將其廣泛應(yīng)用于中藥研究。其課題組的趙惠如等[10]采用細胞膜色譜技術(shù)對當歸中的有效成分進行了篩選，并結(jié)合薄層色譜法分離，通過離體藥理實驗證明了這些成分能夠?qū)ρ芗毎ぜ澳な荏w發(fā)揮作用。趙小娟等[11]利用細胞膜色譜法確定了淫羊藿根中能夠與血管細胞膜及膜受體相互作用的活性成分，并進一步與淫羊藿葉進行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種活性成分在淫羊藿的葉部并不存在，為淫羊藿根的開發(fā)利用和定性定量分析提供了實驗依據(jù)。這些研究表明細胞膜色譜法在中藥研究中具有重要作用。

此外，利用脂質(zhì)體等結(jié)構(gòu)模擬生物膜結(jié)構(gòu)的仿生生物膜色譜技術(shù)也廣泛應(yīng)用于酶、蛋白質(zhì)等活性成分的分離。董倩倩等[12]將仿生物膜色譜技術(shù)與質(zhì)譜等技術(shù)聯(lián)用對丹參水提液中的活性成分進行了分析和鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參水提液中有8 個成分與模擬生物膜存在明顯的相互作用。柴心怡[13]建立了基于膜受體的NKG2A 整體柱生物色譜分析新方法，并利用陽性藥和陰性藥對該方法的有效性進行了考察，結(jié)果證明NKG2A-脂質(zhì)體-整體柱上的NKG2A受體具有特異性識別配體的活性，柱有效性符合要求，并篩選出黃酮類化合物中的主要活性成分為黃芩苷和漢黃芩苷，為膜受體靶向藥物的精準篩選提供了全新的思路和技術(shù)。此外，有報道表明，將仿生物膜色譜法與其他生物色譜技術(shù)結(jié)合在中藥研究中也發(fā)揮了重要的作用[14]。

2.3 細胞生物色譜法在中藥研究中的應(yīng)用

細胞生物色譜法是采用人或動物的活細胞、植物的細胞或細胞壁為固定相，利用動物活細胞的特異性結(jié)合能力或植物細胞中細胞壁的選擇通透性來實現(xiàn)目標化合物的分離與富集的一種生物色譜技術(shù)。

吳祥瑞等[15]以肝細胞為固定相構(gòu)建了細胞生物色譜系統(tǒng)，通過篩選中藥中作用多靶點的活性成分對茵陳蒿湯中的活性成分進行篩選，通過分離和提取得到了其中能夠與肝細胞特異性結(jié)合的活性成分，并確認了其保肝效應(yīng)，初步探索了其作用機理。洪敏等[16]建立了肝細胞固相萃取高效液相色譜分析模型，并采用該模型對梔子中的保肝活性成分進行篩選分析，成功篩選出其中的活性成分——梔子苷，該成分已被證實對多種肝損傷具有良好的保護作用，是梔子中的主要有效成分。這證實了通過該方法篩選得到的保留成分與其藥效之間具有顯著相關(guān)性，可用于中藥這種復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)的分析研究。

3 總結(jié)與展望

生物色譜法是一種用于分離和分析活性成分的技術(shù)，具有特異性高、多靶標、篩選過程快速簡單、重復(fù)性較好等優(yōu)點。它在中藥活性成分的篩選、分離與分析、指紋圖譜分析和質(zhì)量標準制定等方面有著廣泛的應(yīng)用。相比于傳統(tǒng)的分離和藥效篩選方法，生物色譜法能夠?qū)⒒钚猿煞值姆蛛x和篩選結(jié)合在一起，不僅減少了分離和藥效篩選的分離，還能消除無活性成分的干擾，縮小活性成分的篩選范圍。

然而，生物色譜技術(shù)在應(yīng)用中也存在一些問題。例如，生物色譜柱的壽命普遍較短且尚未實現(xiàn)商品化，尤其是用于特異性活性篩選的色譜柱，需要自己制備具有專一屬性的生物色譜柱。同時，在應(yīng)用過程中需要摸索其用于分離和分析的穩(wěn)定條件，這對實驗室條件及操作者的專業(yè)技術(shù)要求較高，因此對該技術(shù)進行推廣和使用較為困難。此外，生物色譜技術(shù)僅應(yīng)用于體外研究，不能完全模擬體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境，因此不能代替對藥效成分在體內(nèi)的作用的研究。

未來，隨著技術(shù)問題的解決和研究的深入，生物色譜技術(shù)在中藥領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要作用，推動中藥現(xiàn)代化發(fā)展。此外，生物色譜技術(shù)在藥動學(xué)、藥效學(xué)、藥物毒性和新藥開發(fā)等領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用。