卓雨欣,徐文娟,程 源,龍 峰(中國(guó)人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院,北京 100872)

抗生素因其特有的優(yōu)異性能而被廣泛應(yīng)用于人的抗感染治療、家禽與水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中疾病預(yù)防、治療和促進(jìn)生長(zhǎng)等[1-4].常用抗生素包括喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)等,僅用于臨床的抗生素就多達(dá)數(shù)百種.由于大多數(shù)抗生素類(lèi)藥物在人和動(dòng)物機(jī)體內(nèi)都不能夠被完全代謝,所以常常以原藥和代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)由糞尿排出而進(jìn)入環(huán)境[2-4].抗生素在自然界化學(xué)穩(wěn)定性很好,需要足夠長(zhǎng)的時(shí)間才能降解成其他物質(zhì),因此,環(huán)境中殘留的抗生素可能通過(guò)各種方式重新進(jìn)入人體,如喝含有抗生素的水、吃殘留抗生素的肉類(lèi)和蔬菜等.研究表明,不同國(guó)家和地區(qū)在地表水、地下水、土壤及沉積物,甚至飲用水源中均檢出抗生素[5-7].據(jù)報(bào)道,我國(guó)兒童普遍暴露于低劑量抗生素中,許多在環(huán)境和食品中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的抗生素在尿樣中頻繁檢出[7-10].抗生素通過(guò)各種途徑進(jìn)入人體并積蓄后,不僅會(huì)使得人體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),而且可能對(duì)人體器官造成毒性損傷、損害神經(jīng)系統(tǒng),甚至可能導(dǎo)致“三致”效應(yīng).同時(shí),抗生素在環(huán)境中的積累導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性增強(qiáng),耐藥基因可通過(guò)環(huán)境、食物鏈等方式傳播至人體;有的形成“超級(jí)細(xì)菌”,難以甚至不可能通過(guò)常規(guī)抗生素來(lái)治療感染,嚴(yán)重威脅到人類(lèi)的生命健康安全[9-11].

世界各國(guó)均對(duì)抗生素的使用提出了嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn),歐盟的標(biāo)準(zhǔn)比日本和美國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)更加嚴(yán)格,限量值更低.2022年,我國(guó)出臺(tái)的《新污染物治理行動(dòng)方案》和《重點(diǎn)管控新污染物清單》中,抗生素被列為重點(diǎn)管控的新污染物[13].為遏制抗生素的濫用和快速監(jiān)測(cè)預(yù)警抗生素的危害,發(fā)展靈敏度高、選擇性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的抗生素現(xiàn)場(chǎng)快速定量分析新原理和新方法至關(guān)重要.

現(xiàn)有的抗生素檢測(cè)方法包括色質(zhì)聯(lián)用法、微生物法和生物親和分析法等[9,12-16].色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng),但儀器昂貴、程序復(fù)雜、檢測(cè)成本高;而發(fā)展較早的微生物檢測(cè)法需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)誤差大,不適用于抗生素的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)定量檢測(cè).生物親和分析法是利用生物親和反應(yīng)原理進(jìn)行抗生素的檢測(cè),因具有分析速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等顯著優(yōu)勢(shì)而備受人們青睞.其中,基于免疫反應(yīng)原理的光學(xué)生物傳感技術(shù)既具備光學(xué)檢測(cè)的高靈敏性,又具有生物親和反應(yīng)的高特異性,正在成為抗生素現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)定量檢測(cè)領(lǐng)域的一顆璀璨明珠[17-18].更為重要的是,融合智能手機(jī)的生物傳感器因其具有智能化、便攜化、高靈敏、高特異性等優(yōu)勢(shì),正在成為環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿.

本研究通過(guò)融合激光誘導(dǎo)熒光原理和光纖傳感原理,集成全光纖光學(xué)系統(tǒng)、微型化流動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、高靈敏光電探測(cè)系統(tǒng)和基于智能手機(jī)的APP 軟件,發(fā)展了用于水中NOR 現(xiàn)場(chǎng)快速靈敏檢測(cè)的便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器.結(jié)合間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析機(jī)制,建立了用于NOR 現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)的新方法,并用于各種水樣中NOR 的靈敏檢測(cè).結(jié)合物聯(lián)網(wǎng)等新興技術(shù),該儀器可根據(jù)設(shè)定的程序?qū)z測(cè)結(jié)果直接上傳環(huán)境監(jiān)測(cè)監(jiān)管中心,從而為實(shí)現(xiàn)水環(huán)境安全的監(jiān)測(cè)預(yù)警和應(yīng)急監(jiān)測(cè)提供重要技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3-巰基丙基三甲基硅烷(MTS)、N-(4-馬來(lái)酰亞胺基丁酰氧基)丁二酰亞胺(GMBS)、牛血清蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma-Aldrich(美國(guó)).濃硫酸、30%氫氟酸、鹽酸、30%過(guò)氧化氫、甲苯、乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、二甲基砜(DMSO)、卡那霉素(Kanamycin,KANA)、氨卡西林(Ampicillin,AMP)均由北京化學(xué)試劑(中國(guó)北京)提供,試劑純度均為分析純.NOR 標(biāo)準(zhǔn)品、NOR 抗體均購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司.氟蟲(chóng)腈(Fipronil,FIP)、啶蟲(chóng)脒(Acetamiprid,ACE)及其抗體由河北省科學(xué)研究院提供.磷酸鹽緩沖液(PBS)(137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、4.3mmol/L Na2HPO4、1.4mmol/L KH2PO4,pH=7.4)、抗體稀釋液(1.0g BSA、100mL 0.01mol/L PBS)和再生溶液(十二烷基硫酸鈉,SDS,0.5%,pH=1.9)自行制備.

1.2 儀器:便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器

如圖1所示,儀器主要由全光纖光學(xué)系統(tǒng)、微型化流動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、高靈敏光電探測(cè)系統(tǒng)等模塊組成.其中,基于Y-型光纖耦合器的全光纖光學(xué)系統(tǒng)是微型熒光生物傳感器小型化的核心.635nm 激發(fā)光經(jīng)Y-型光纖耦合器的單模光纖進(jìn)入光纖探頭以全內(nèi)反射方式傳輸,并在其表面形成有效滲入深度約為100nm 的倏逝波.倏逝波誘導(dǎo)通過(guò)親和反應(yīng)結(jié)合光纖探頭表面的熒光標(biāo)記生物識(shí)別分子發(fā)出熒光,部分熒光耦合回光纖探頭,經(jīng)Y-型光纖耦合器的多模光纖傳輸和濾光片濾除雜散光,由高靈敏光電探測(cè)器探測(cè)到并轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)的電信號(hào).Y-型光纖耦合器的使用最大限度地減少了光學(xué)分離元件,有效地提高光的傳輸效率,并極大地減少了儀器體積.

圖1 便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器Fig.1 Portable smartphone powered fluorescent biosensors

為提升儀器檢測(cè)的自主性和智能化,研發(fā)了基于智能手機(jī)安卓平臺(tái)的APP 軟件.該軟件主要包含儀器參數(shù)設(shè)置與控制、目標(biāo)物實(shí)時(shí)檢測(cè)、信息查詢(xún)與傳輸、藍(lán)牙連接等模塊.智能手機(jī)通過(guò)藍(lán)牙連接模塊和modbus 協(xié)議操控便攜式熒光生物傳感器,該傳感器的主控芯片接收來(lái)自智能手機(jī)的指令以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測(cè),并將檢測(cè)的光電信號(hào)等數(shù)據(jù)上傳至智能手機(jī).利用該APP,可實(shí)現(xiàn)熒光生物傳感器的智能控制和檢測(cè)的自主化,并用于檢測(cè)信息的接收、處理和存儲(chǔ).

1.3 光纖探頭的功能化

為用于NOR 的免疫分析,需要將光纖探頭表面修飾包被抗原NOR-OVA.具體步驟如下:①光纖探針的錐型化,即將直徑為600μm(NA=0.22,5.5cm)的石英多模光纖用氫氟酸腐蝕成組合錐形結(jié)構(gòu).②將其置于食人魚(yú)溶液(H2SO4:H2O2=3:1)中浸泡30min后取出,超聲清洗后烘干,此時(shí),光纖探頭表面形成羥基.③光纖探頭硅烷化,即將羥基化的光纖探頭置于體積比為2%的MTS甲苯溶液中在37℃條件下反應(yīng)2h,使用甲苯清洗后用氮?dú)獯蹈?④將硅烷化光纖探頭浸于雙功能試劑GMBS(20nmol/L)乙醇溶液中,反應(yīng)1h,使用PBS沖洗.⑤包被抗原固定,即將光纖探頭置入0.5mg/mL NOR-OVA 溶液中,4℃反應(yīng)過(guò)夜.⑥將包被抗原功能化的光纖探頭放入2mg/mL BSA 溶液中反應(yīng)2h,以封閉光纖探頭表面的活性位點(diǎn).功能化光纖探頭放入4℃下冷藏備用.

1.4 實(shí)際樣品的預(yù)處理與檢測(cè)

為評(píng)價(jià)便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器及其檢測(cè)方法的實(shí)用性和可靠性,對(duì)自來(lái)水、地表水和二沉池出水等實(shí)際水樣進(jìn)行NOR 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),所有樣品均平行檢測(cè)3 次.

2 結(jié)果與討論

2.1 基于便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器的NOR 免疫分析原理

如圖2所示,先將熒光標(biāo)記NOR 抗體與樣品混合預(yù)反應(yīng)一段時(shí)間,樣品中NOR 與部分熒光標(biāo)記抗體結(jié)合.其結(jié)合量與樣品中NOR 濃度成正比例關(guān)系.然后利用便攜式熒光生物傳感器內(nèi)置的蠕動(dòng)泵將混合液泵入樣品池,含有自由結(jié)合位點(diǎn)的熒光標(biāo)記抗體可與光纖探頭表面的包被抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而結(jié)合到光纖表面.由于激發(fā)光在光纖探頭內(nèi)以全內(nèi)反射方式傳播,產(chǎn)生的倏逝波滲入深度僅為100nm 左右,因此,僅有結(jié)合到光纖表面的熒光標(biāo)記抗體才能被激發(fā),溶液中熒光標(biāo)記抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很少.被激發(fā)的熒光部分耦合回光纖探頭,最終由光電探測(cè)器檢測(cè)并轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的電信號(hào).電信號(hào)通過(guò)藍(lán)牙模塊實(shí)時(shí)傳輸至智能手機(jī)APP 軟件并顯示在用戶(hù)界面(圖2b).當(dāng)樣品中NOR 濃度越高,結(jié)合到光纖探頭的熒光標(biāo)記抗體量越少,檢測(cè)到的熒光信號(hào)越低.根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與樣品中NOR 濃度的線性關(guān)系即可實(shí)現(xiàn)其定量檢測(cè).為重復(fù)使用光纖探頭,使用0.5%的SDS(pH=1.9)溶液對(duì)光纖探頭進(jìn)行再生,洗脫結(jié)合到光纖探頭的抗體,經(jīng)PBS 緩沖液沖洗可進(jìn)行循環(huán)使用.

圖2 基于便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器的NOR 免疫分析原理Fig.2 NOR immunoassay principle based on portable smartphone powered fluorescent biosensor

2.2 功能化光纖探頭的性能表征

為驗(yàn)證NOR-OVA 功能化光纖探頭的適用性,進(jìn)行了以下對(duì)照實(shí)驗(yàn).①將1.0μg/mL Cy5.5-NOR 抗體通入樣品池反應(yīng)5min,便攜式熒光生物傳感器檢測(cè)到的熒光信號(hào)值約為98(圖3a);②將1.0μg/mL Cy5.5 標(biāo)記的氟蟲(chóng)腈抗體和啶蟲(chóng)脒抗體分別加入樣品池,5min 后檢測(cè)到的熒光信號(hào)值分別為10 和12,遠(yuǎn)小于NOR 抗體的熒光信號(hào)值,表明功能化光纖探頭的非特異性吸附較小.③將1.0μg/mL Cy5.5-NOR抗體與6.0μg/L NOR 預(yù)反應(yīng)5min 后,通入樣品池反應(yīng)5min,其信號(hào)響應(yīng)值為39,相較于未加NOR 的實(shí)驗(yàn)熒光信號(hào)值有較大降低,但高于其他抗體的熒光信號(hào)值.以上結(jié)果表明,NOR-OVA 包被抗原被成功修飾到光纖探頭表面,對(duì)NOR 抗體具有較好的特異性識(shí)別能力;結(jié)合間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析原理,可以用于NOR 的定量檢測(cè).

圖3 功能化光纖探針的性能表征Fig.3 Performance characterization of functionalized fiber optic probes

同時(shí),測(cè)試了功能化光纖探頭的可重復(fù)使用性能.結(jié)果顯示,NOR-OVA 修飾的光纖探頭可重復(fù)使用上百次,且其性能沒(méi)有顯著變化(圖3b),其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<4.5%.這不僅有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性,也可顯著降低檢測(cè)成本,單次檢測(cè)成本<1 元/次.

2.3 NOR 免疫分析條件的優(yōu)化

為在保障NOR 免疫分析性能的前提下,縮短檢測(cè)時(shí)間,對(duì)預(yù)反應(yīng)時(shí)間和免疫反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化.首先,將1.0μg/mL熒光標(biāo)記的NOR抗體與2.0μg/mL NOR 混合(各30.0μL)分別反應(yīng)0,1,3 和5min 后,加入樣品池中反應(yīng)5min,并檢測(cè)其熒光信號(hào)值.圖4a顯示熒光信號(hào)值隨著預(yù)反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,當(dāng)預(yù)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)5min 后,熒光信號(hào)值不再明顯下降,表明熒光標(biāo)記抗體與NOR 結(jié)合達(dá)到平衡.因此,最佳預(yù)反應(yīng)時(shí)間為5min.

圖4 NOR 免疫分析條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of NOR immunoassay conditions

其次,當(dāng)熒光標(biāo)記的NOR 抗體與NOR 反應(yīng)混合物加入樣品池后,含有自由親和位點(diǎn)的抗體會(huì)與光纖探頭表面固定的包被抗原結(jié)合.隨著結(jié)合的抗體量增加,便攜式熒光生物傳感器檢測(cè)到熒光信號(hào)值逐漸增大.為縮短檢測(cè)時(shí)間,將免疫反應(yīng)時(shí)間定為5min,此時(shí),可以檢測(cè)到明顯的熒光信號(hào)響應(yīng).雖然該熒光信號(hào)值未達(dá)到最大值,但是當(dāng)免疫反應(yīng)時(shí)間一定時(shí),儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)值與待測(cè)物濃度成比例關(guān)系,可用于其定量檢測(cè).

2.4 NOR 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為實(shí)現(xiàn)便攜式熒光生物傳感器對(duì)NOR 的定量檢測(cè),需要建立其檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線.為此,將NOR 儲(chǔ)備液稀釋至系列濃度(0.5,1.0,2.5,5.0,7.5,10.0,20.0 和50.0μg/L),與5.0μg/mL 的標(biāo)記抗體等體積混合,預(yù)反應(yīng)3min 之后將其通入樣品池.在反應(yīng)5min 后,檢測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度(圖5a).從圖5a 可知,熒光信號(hào)值隨NOR 濃度的增加而降低.這是由于樣品中NOR 濃度的提高會(huì)使其結(jié)合更多的熒光標(biāo)記抗體,導(dǎo)致結(jié)合到光纖探頭的熒光標(biāo)記抗體量減少,從而使得檢測(cè)到的熒光信號(hào)值降低.檢測(cè)完成后,使用0.5% SDS溶液對(duì)光纖探頭進(jìn)行再生.

圖5 基于便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器的NOR 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立Fig.5 The standard curve of NOR based on portable smartphone powered fluorescence biosensor

對(duì)各種NOR 濃度的熒光信號(hào)值進(jìn)行歸一化處理后,依據(jù)logistics 模型,對(duì)歸一化信號(hào)與NOR 濃度的關(guān)系進(jìn)行擬合,得到NOR 定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5b).將最大信號(hào)值的20%～80%對(duì)應(yīng)的濃度區(qū)間為動(dòng)態(tài)線性檢測(cè)區(qū)間,即NOR 的線性檢測(cè)區(qū)間為1.6～20.6μg/L.NOR 的檢測(cè)限為0.35μg/L.這些結(jié)果表明,便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器對(duì)于NOR 的檢測(cè)具有良好的靈敏度.

表1 比較了目前常用方法的特點(diǎn),從中可以看出,基于便攜式智能手機(jī)的倏逝波熒光檢測(cè)方法相較于色譜,ELISA 等檢測(cè)方法,具有無(wú)需預(yù)處理,檢測(cè)快速簡(jiǎn)單且靈敏度高的優(yōu)勢(shì),同時(shí)在成本等方面也具有明顯優(yōu)勢(shì)[19].

表1 常見(jiàn)檢測(cè)方法對(duì)比Table 1 Comparison of common detection methods

2.5 生物傳感器的選擇性

生物傳感器的選擇性是衡量其檢測(cè)結(jié)果可靠性的重要指標(biāo)之一.為此,分別將5.0μg/mL 的熒光標(biāo)記NOR 抗體與10μg/L 諾氟沙星(NOR)、卡那霉素(KANA)、啶蟲(chóng)脒(ACE)、氨卡西林(AMP)等體積混合,預(yù)反應(yīng)3min之后將其通入樣品池.在反應(yīng)5min后,檢測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度.由圖6 可知,只有在NOR 存在的情況下,檢測(cè)信號(hào)才有明顯下降;而當(dāng)其他3 種干擾物存在時(shí),其熒光信號(hào)基本與空白樣品的檢測(cè)信號(hào)一致,說(shuō)明NOR 抗體具有良好的選擇性,可以實(shí)現(xiàn)NOR的特異性檢測(cè).

圖6 生物傳感器的選擇性Fig.6 Selectivity of biosensors

2.6 實(shí)際水樣中NOR 的檢測(cè)

為評(píng)估便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器用于NOR 檢測(cè)的實(shí)用性,使用建立的方法對(duì)地表水、自來(lái)水、地下水和二沉池出水進(jìn)行了加標(biāo)回收測(cè)試.由表2 可知,NOR 的加標(biāo)回收率在85%～120%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差少于5%,這表明便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,可以用于實(shí)際水樣中NOR 的定量檢測(cè).在實(shí)際應(yīng)用中,APP 軟件設(shè)定不同樣品中特定目標(biāo)物的檢出限,當(dāng)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果高于檢出限,即可預(yù)警檢出結(jié)果異常,提示應(yīng)采取進(jìn)一步處理處置措施.

表2 便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器用于水樣中NOR 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery rates of various spiked water samples using portable smartphone powered fluorescent biosensor

本研究?jī)H考察了便攜式熒光生物傳感器用于NOR 的檢測(cè),為拓展其應(yīng)用范圍,可通過(guò)簡(jiǎn)單更換相應(yīng)的光纖探頭和熒光標(biāo)記抗體,建立用于其他抗生素和環(huán)境污染物的高靈敏檢測(cè)方法.因用于NOR 檢測(cè)的抗體性能會(huì)受溫度、pH 值等因素的影響,因此這些因素的變化可能會(huì)影響NOR 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,后續(xù)將繼續(xù)研究NOR 的優(yōu)化檢測(cè)條件.總的來(lái)說(shuō),由于智能手機(jī)和微型光學(xué)系統(tǒng)的使用,便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器不僅可以實(shí)現(xiàn)NOR 的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè),而且可結(jié)合物聯(lián)網(wǎng)等新興技術(shù),根據(jù)設(shè)定的程序?qū)z測(cè)結(jié)果直接上傳環(huán)境監(jiān)測(cè)監(jiān)管中心,為保障水環(huán)境安全的監(jiān)測(cè)預(yù)警和應(yīng)急監(jiān)測(cè)提供重要技術(shù)支持.

3 結(jié)論

3.1 運(yùn)用研發(fā)的便攜式智能手機(jī)賦能熒光生物傳感器,結(jié)合間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析原理,建立了NOR 現(xiàn)場(chǎng)快速靈敏傳感檢測(cè)技術(shù).

3.2 在優(yōu)化條件下,便攜式熒光生物傳感器對(duì)NOR的檢測(cè)限可達(dá) 0.35μg/L,線性檢測(cè)范圍為 1.6～20.6μg/L.

3.3 本研究所建立的NOR 檢測(cè)方法可用于多種水樣中NOR 的加標(biāo)回收檢測(cè),其回收率為85%～120%,表明其可以用于實(shí)際水樣中NOR 的快速檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間少于15min.