陳麗瑤,連澤陽(yáng),宋衛(wèi)鋒,戴文燦,楊佐毅,孫夢(mèng)格,黃祥武,白曉燕(廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州510006)

現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展伴隨著含重金屬?gòu)U物的增加,其中Cd(II)和Zn(II)就是典型的重金屬,一旦進(jìn)入水體,即使?jié)舛群艿鸵矔?huì)被微生物積累,沿著食物鏈傳遞,最終富集在人體內(nèi),進(jìn)而損害人體的正常生理功能[1].開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的重金屬?gòu)U水處理技術(shù)一直是研究者追求的目標(biāo).在實(shí)踐中,經(jīng)常遇到廢水中的重金屬離子濃度較低的情形,使用傳統(tǒng)的處理技術(shù)效果并不理想.近年來(lái),包括胞外聚合物(EPS)在內(nèi)的生物吸附方法得到較廣泛的研究,且對(duì)低濃度重金屬具有較高的去除效率[2].

EPS 是微生物產(chǎn)生的多組分聚合物,以膜的形式包被在細(xì)胞膜上或以溶解或膠體形式分散在細(xì)胞外.蛋白質(zhì)、多糖和核酸是EPS 的主要成分,其中蛋白質(zhì)約占總量的70%～80%[3].除了在維持微生物聚集體的結(jié)構(gòu)和功能完整性方面起著非常重要的作用外,EPS 也可以利用配位、絡(luò)合、陰陽(yáng)離子交換等作用來(lái)吸附重金屬.低濃度重金屬可以刺激微生物產(chǎn)生具有大量配體的EPS,與重金屬結(jié)合,使之失去流動(dòng)性以保全細(xì)胞[4].EPS 是一種具有極大潛力的重金屬生物吸附劑.

微生物產(chǎn)生EPS 受多種因素的影響,碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)條件,pH 值、金屬離子和溫度等外部條件都會(huì)影響微生物EPS 的產(chǎn)生[5].其中,重金屬是關(guān)鍵因子.近年來(lái)許多科研人員集中在重金屬對(duì)細(xì)菌的脅迫研究上.革蘭氏陽(yáng)性菌(G+菌)中肽糖和二葉酸的含量較高,因此,被認(rèn)為具有更優(yōu)的吸附性能[6].V?lke 等[7]以Ni(II)和 Cu(II)為脅迫因子,比較了兩者對(duì)Halobacterium salinarum R1 產(chǎn)生EPS 的效應(yīng),發(fā)現(xiàn)Cu(II)脅迫下產(chǎn)生的EPS 含量比同等條件下的Ni(II)產(chǎn)生的多.Zeng 等[8]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在金屬離子脅迫下,Bacillus sp.S3 產(chǎn)生的EPS 含量增加,并通過(guò)與表面官能團(tuán)絡(luò)合間接降低這些重金屬的毒性.有研究表明,由于革蘭氏陰性菌(G-菌)較敏感,在重金屬,比如Cd(II)的脅迫/誘導(dǎo)下比較容易出現(xiàn)相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)[9].在一定濃度的Cd(II)刺激下,G-菌EPS 的含量、組成等也可能隨之變化.近年來(lái)逐漸出現(xiàn)了關(guān)于脅迫/誘導(dǎo)G-菌產(chǎn)生EPS 的研究.孫夢(mèng)格等[10]發(fā)現(xiàn)在最佳Cd(II)濃度脅迫下,Pseudomonas aeruginosa 的EPS 總產(chǎn)量可達(dá)到最大值,其中的蛋白組分起到關(guān)鍵作用.Qu 等[11]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)在Pseudomonas putida 中,巰基和磷酸二酯基團(tuán)優(yōu)先與Pb(II)絡(luò)合,促進(jìn)了Pb(II)的吸附.黃祥武等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選發(fā)現(xiàn)HCOONa脅迫/誘導(dǎo)后,EPS中C-O/C-N、C=O、C=N 等官能團(tuán)的濃度明顯增加,可能是吸附Cd(II)的主要基團(tuán).在相關(guān)文獻(xiàn)中,研究者的重點(diǎn)主要集中在重金屬離子對(duì)G-菌的脅迫效應(yīng),實(shí)際上陰離子的作用也不可忽視.另外,目前的研究對(duì)象幾乎全部為單一金屬,脅迫下的EPS 對(duì)重金屬的吸附選擇性探究遠(yuǎn)未充分.

本研究使用菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa),屬于革蘭氏陰性菌,金屬耐受性較強(qiáng)[13].探討了在3 種不同Cd(II)化合物的脅迫/誘導(dǎo)下,P.aeruginosa EPS 的產(chǎn)量及其吸附性能的變化.此研究的獨(dú)特之處在于:通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究不同陰離子Cd(II)化合物對(duì)EPS 產(chǎn)量和組成的影響、對(duì)吸附性能和吸附選擇性的影響和對(duì)蛋白質(zhì)中氨基酸種類的影響,以及上述組分變化和氨基酸種類變化與吸附性能之間的關(guān)系.

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用菌種為購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏管理中心的P.aeruginosa,經(jīng)復(fù)蘇活化培養(yǎng)后,于-20℃保存.

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:3.2g 營(yíng)養(yǎng)瓊脂干粉培養(yǎng)基,用超純水定容到100mL 配得[14].

LB 培養(yǎng)基:10g 蛋白胨,10g NaCl、5g 酵母粉,用超純水定容至1000mL 配得.將培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)至7.2,在121℃的高壓滅菌鍋滅菌20min 后,置于超凈工作臺(tái)冷卻[14].

1.2 活化與培養(yǎng)

P.aeruginosa 復(fù)蘇后,平板劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,在30°C 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,觀察到菌落明顯,挑取單個(gè)菌落到100mL LB 培養(yǎng)基上,在30°C、150r/min 的恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24h 后,用甘油于-20℃下保存菌液.

然后以5%(體積分?jǐn)?shù))將菌液接種到95mL 的LB 培養(yǎng)基中,并在37°C、150r/min 的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24h.將菌株以5%(體積分?jǐn)?shù))分別接種到0～80mg/L 濃度梯度的3 種Cd(II)化合物的LB 培養(yǎng)基中,并在37°C、150r/min 的恒溫?fù)u床中脅迫培養(yǎng)24h.上述接種過(guò)程均在超凈工作臺(tái)操作.

1.3 EPS 的提取與測(cè)定

本文采用加熱法提取EPS[14].取30mL 脅迫培養(yǎng)后的菌液于離心管中,置于高速冷凍離心機(jī)(4°C,1850g)離心15min;倒掉上清液,用0.9% NaCl震蕩洗滌菌體后,在高速冷凍離心機(jī)(4°C,1850g)離心15min;倒掉上清液,加入0.9% NaCl 溶液,震蕩洗滌使成為菌懸液.將菌懸液置于60°C 恒溫水浴鍋中加熱30min,而后在高速冷凍離心機(jī)(4°C,7400g)中離心15min.上清液經(jīng)0.45μm 濾膜過(guò)濾,在超純水中用磁力攪拌器透析24h,移取透析后的液體于-20°C 保存?zhèn)溆?

EPS(mg/g VSS)的產(chǎn)量由蛋白質(zhì)、多糖和核酸組成,分別采用考馬斯亮藍(lán)法[15]、硫酸蒽酮法[16]和二苯胺法[17]測(cè)定.

1.4 吸附實(shí)驗(yàn)

將脅迫/誘導(dǎo)培養(yǎng)后提取的P.aeruginosa EPS等質(zhì)量(1mg)添加到15mg/L、pH = 5 的Cd(NO3)2溶液中.在30°C、150r/min 的恒溫?fù)u床中振蕩吸附2h 后,于200mL 超純水中透析12h.透析后溶液中Cd(II)離子的濃度由火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定.

EPS 重金屬吸附的計(jì)算如下:

式中:Q 是EPS 吸附重金屬的量,mg/g EPS;C0是金屬離子的初始濃度,mg/L;V0是溶液的體積,L;Ct是透析液中金屬離子的濃度,mg/L;Vt是透析液的體積,L;m是EPS 的質(zhì)量,g.

1.5 EPS 表征分析

1.5.1 三維熒光光譜(3D-EEM)分析 EPS 通過(guò)3D-EEM(英國(guó)愛(ài)丁堡)分析.掃描間隔為5nm,激發(fā)光(Ex)范圍為 200～500nm,發(fā)射光(Em)范圍為 280～550nm.

1.5.2 高效液相色譜(HPLC)分析 在該實(shí)驗(yàn)中,EPS 中氨基酸的變化通過(guò)HPLC(美國(guó)安捷倫)進(jìn)行分析.除了在440nm 處檢測(cè)到脯氨酸外,其他氨基酸在250nm 處檢測(cè)到.

1.5.3 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析 通過(guò)乙醇沉淀對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理后,將沉淀物冷凍干燥并與KBr 混合[18].壓縮后,通過(guò)FTIR(德國(guó)布魯克)分析,分析波長(zhǎng)為400～4000cm-1.

1.5.4 X 射線光電子能譜(XPS)分析 EPS 中C 和O 價(jià)態(tài)的變化由XPS(美國(guó)賽默飛)確定.XPS 光譜峰由Avantage 分析.

1.6 競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)

配制濃度為15mg/L的Zn(II)溶液和Cd(II)溶液,將其分別作為雙組分系統(tǒng)下吸附Cd(II)或Zn(II)的固定離子,保持其他條件一致,探究在不同時(shí)間、不同初始濃度的 Cd(II)或 Zn(II)下,Control-EPS、Cd(NO3)2-EPS 吸附性能的變化.單組分吸附等溫模型實(shí)驗(yàn)在先前工作已經(jīng)開展,相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表4[14].

競(jìng)爭(zhēng)性Langmuir 模型的計(jì)算如下:

式中:Qe,i是雙組分系統(tǒng)下i 離子的平衡吸附量,mg/g EPS;Qm,i是單組分Langmuir 等溫線模型i 離子的最大吸附量,mg/g EPS;KL,i,KL,j是單組分Langmuir等溫線模型的吸附常數(shù),L/mg;Ce,i,Ce,j是i 離子的平衡濃度和j 離子的固定濃度,mg/L.

2 結(jié)果和討論

經(jīng)過(guò)3 種不同Cd(II)化合物脅迫/誘導(dǎo)后的P.aeruginosa EPS 分別記為CdCl2-EPS、CdSO4-EPS、Cd(NO3)2-EPS,未脅迫/誘導(dǎo)EPS 記為Control-EPS.

2.1 脅迫/誘導(dǎo)下P.aeruginosa EPS 的組分及含量

由圖1 可知,在3 種脅迫/誘導(dǎo)條件下,EPS 產(chǎn)量的總體趨勢(shì)為先增后減,3 種EPS 產(chǎn)量都在50mg/L Cd(II)脅迫/誘導(dǎo)下效果最佳.此外,Cd(NO3)2是最好的脅迫/誘導(dǎo)劑,CdCl2效果次之,CdSO4最差.當(dāng)Cd(NO3)2為50mg/L 時(shí),Cd(NO3)2-EPS 產(chǎn)量達(dá)到頂峰,為214.91mg/g VSS.蛋白質(zhì)含量增加最為顯著,達(dá)到136.75mg/g VSS,比脅迫前的26.85mg/g VSS增加了 409.31%.多糖產(chǎn)量達(dá)到 57.89mg/g VSS,比Control-EPS 產(chǎn)生的33.57mg/g VSS 多糖增加了72.45%.DNA 產(chǎn)量達(dá)到20.27mg/g VSS,比Control-EPS 產(chǎn)生的1.01mg/g VSS DNA 增加了19 倍以上.

圖1 脅迫/誘導(dǎo)下的EPS 產(chǎn)量及吸附性能Fig.1 EPS component contents and adsorption capacity under stress/induction

對(duì)于P.aeruginosa,Cd(II)是一種會(huì)對(duì)菌株的正常生理活動(dòng)產(chǎn)生不利影響的有毒物質(zhì).因此,菌株需要產(chǎn)生更多的EPS 來(lái)抵御這種不利環(huán)境,防止Cd(II)進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)[19].另一方面,EPS 是由細(xì)胞代謝分泌的或膜裂解產(chǎn)生的,當(dāng)Cd(II)超過(guò)一定濃度時(shí),細(xì)胞內(nèi)活性氧的濃度增加,從而破壞細(xì)胞組織和DNA,細(xì)胞內(nèi)器官和DNA 溶出,此時(shí)胞外DNA 會(huì)增加,但細(xì)胞已失活.由于固有的DNA 修復(fù)系統(tǒng)的持續(xù)存在,生物體重新獲得了生命,生物體獲得了對(duì)重金屬鎘的耐受性[20].

根據(jù)上述結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)在相同 Cd(II)濃度下,NO3-比SO42-、Cl-起到了更大的作用.具體體現(xiàn)為,在最佳脅迫/誘導(dǎo)濃度(50mg/L Cd(II))下,Cd(NO3)2-EPS 產(chǎn)量最高.Alipanah 等[21]通過(guò)控制變量來(lái)限制氮源,發(fā)現(xiàn)氮源不存在時(shí),Phaeodactylum tricornutum 的氨基酸合成途徑被轉(zhuǎn)錄抑制,使得蛋白質(zhì)合成減少.Cd(NO3)2中的NO3-可以充當(dāng)細(xì)菌的額外氮源,以合成蛋白質(zhì),進(jìn)一步合成更多的EPS[22].

2.2 脅迫/誘導(dǎo)下P.aeruginosa EPS 的吸附性能

根據(jù)2.1 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提取相應(yīng)的EPS 進(jìn)行Cd(II)吸附實(shí)驗(yàn),可得不同Cd(II)化合物脅迫/誘導(dǎo)下的P.aeruginosa EPS 吸附性能變化.

整體而言,EPS 對(duì)Cd(II)的平衡吸附量隨CdCl2、CdSO4、Cd(NO3)2濃度的增加而表現(xiàn)出先增后減的變化.經(jīng)過(guò)Cd(NO3)2脅迫/誘導(dǎo)后產(chǎn)生的EPS 吸附效果最好(圖1).具體體現(xiàn)為,在50mg/L Cd(NO3)2脅迫下,EPS 對(duì)Cd(II)的平衡吸附量為232.41mg/g EPS,而Control-EPS 對(duì)Cd(II)的平衡吸附量為162.70mg/g EPS,即增加了42.85%.由2.1 可知,Cd(NO3)2脅迫/誘導(dǎo)后EPS 的蛋白質(zhì)含量增加最多.因此,EPS 產(chǎn)量與吸附重金屬能力之間存在一定的線性關(guān)系,也即不同陰離子Cd(II)化合物可以促進(jìn)EPS 蛋白質(zhì)的合成,從而增加對(duì)重金屬吸附能力.

此外,還進(jìn)行了P.aeruginosa EPS 吸附性能與多糖和蛋白質(zhì)含量之間的相關(guān)性分析,如圖2所示.可以知道EPS 的吸附性能與蛋白質(zhì)含量較為相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.6203～0.7302.相比之下EPS 與多糖含量關(guān)系不明確,相關(guān)系數(shù)最小僅為0.2295.因此,蛋白質(zhì)在EPS 吸附重金屬的過(guò)程中起著更為重要的作用.該結(jié)論與孫夢(mèng)格等[10]的研究一致.蛋白中官能團(tuán)的含量在脅迫后有所增加,并且增加幅度越大,EPS 對(duì)重金屬的去除效果越好.這些官能團(tuán)可以提供更多的位點(diǎn)來(lái)結(jié)合重金屬,從而提高EPS 的吸附能力[23].

圖2 脅迫/誘導(dǎo)下EPS 的多糖(a)、蛋白質(zhì)(b)與吸附性能的線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship on EPS between polysaccharide(a),protein(b)and adsorption capacity under stression/induction

2.3 脅迫/誘導(dǎo)下P.aeruginosa EPS 的特性研究

2.3.1 脅迫/誘導(dǎo)前后P.aeruginosa EPS 的3DEEM 分析 如圖3所示,可觀測(cè)到兩個(gè)峰,分別位于275/325nm 的A 峰和236/330nm 處的B 峰.這些峰表明EPS 含有類色氨酸熒光物質(zhì)和類酪氨酸熒光物質(zhì),且A 峰強(qiáng)度均高于B 峰,表明類色氨酸在EPS中的作用強(qiáng)于類酪氨酸,類色氨酸是EPS 與Cd(II)結(jié)合的重要絡(luò)合物質(zhì)[24].

圖3 脅迫/誘導(dǎo)下EPS 的三維熒光光譜圖Fig.3 3D-EEM of EPS under stress/induction

熒光強(qiáng)度與EPS 含量密切相關(guān)[25].由表1 可知,脅迫/誘導(dǎo)后,A 峰和B 峰的強(qiáng)度顯著高于脅迫/誘導(dǎo)前,且 Cd(NO3)2-EPS 的熒光強(qiáng)度變化最大.在Cd(NO3)2脅迫/誘導(dǎo)下,A 峰強(qiáng)度從4.1×105增加到5.9×105,提高了43.90%,B 峰強(qiáng)度從3.5×105增加到5.2×105,提高了48.57%.類色氨酸和類酪氨酸表示蛋白類物質(zhì),表明脅迫/誘導(dǎo)對(duì)EPS 中蛋白質(zhì)的影響較大,且NO3-作為無(wú)機(jī)氮源時(shí),EPS 產(chǎn)量最高[26].與CdCl2和CdSO4相比,Cd(NO3)2可以為菌株提供氮源,用于合成EPS 中的氨基酸和蛋白質(zhì),使菌株能夠抵御濃度更高的Cd(II)[27].以上結(jié)果表明,EPS 的組成可以通過(guò)不同的Cd(II)化合物脅迫/誘導(dǎo)進(jìn)行定向調(diào)控,通過(guò)增加蛋白質(zhì)的含量,提供更多的官能團(tuán),如C=O 和C-N/C-O 等,為重金屬的去除提供更多的吸附位點(diǎn).

表1 脅迫/誘導(dǎo)下EPS 的熒光信息Table 1 Fluorescence information of EPS under stress/induction

2.3.2 脅迫/誘導(dǎo)前后P.aeruginosa EPS 的HPLC分析 根據(jù)圖2b 可知,蛋白質(zhì)在吸附中起較重要的作用.因此,采用高效液相色譜分析不同脅迫/誘導(dǎo)條件下EPS 蛋白質(zhì)中的氨基酸組成.

從圖4 可以看出,在脅迫/誘導(dǎo)后,氨基酸的組成和比例發(fā)生了一些變化.苯丙氨酸(PHE)、賴氨酸(LYS)、脯氨酸(PRO)、絲氨酸(SER)和谷氨酸(GLU)的比例增加,其中PHE 的占比從51.78%分別增加到58.62%、65.54%和51.92%,LYS 的占比從2.48%增加到最高為15.42%,SER 的占比均從0.40%增加了50%以上,最高增加到了3.29%.

圖4 脅迫/誘導(dǎo)下EPS 的氨基酸物質(zhì)的量百分比Fig.4 Mole percentage of EPS amino acid under stress/induction

天冬氨酸(ASP)、蘇氨酸(THR)和組氨酸(HIS)的比例下降,其中ASP 的比例從Control-EPS 的26.09% 分別降為 CdCl2-EPS 的 14.81% 、CdSO4-EPS 的 7.81% 和 Cd(NO3)2-EPS 的10.62%,THR 的比例從Control-EPS 的2.12%分別降為CdCl2-EPS 的0.48%、CdSO4-EPS 的0.11%和Cd(NO3)2-EPS 的0.43%.其他氨基酸變化不明顯.從構(gòu)成上看,PHE 占EPS 總氨基酸的一半以上,其次是ASP、y-氨基丁酸(GABA)、LYS、異亮氨酸(IIE)、GLU.

PHE 為α-氨基酸,有文獻(xiàn)認(rèn)為,其含量增加有助于EPS 與Cd(II)結(jié)合并降低對(duì)微生物的毒性[28].LYS 中除羧基外,還同時(shí)存在α-氨基和ε-氨基,有研究表明,Co(I)與LYS 的α-氨基和羧基配位,Cu(II)還可以與ε-氨基配位[29].因此,脅迫/誘導(dǎo)后EPS 中LYS的增加可以使吸附朝有利方向進(jìn)行.PRO 是有效的金屬螯合劑,小球藻在重金屬脅迫下會(huì)分泌更多的PRO,保護(hù)細(xì)胞免受重金屬毒性作用[30-31];SER 和GLU 分子結(jié)構(gòu)中具有極性側(cè)鏈,可以提供極性側(cè)鏈原子、羧酸氧原子和胺氮原子,與Cu(II)配位后具有較高的穩(wěn)定性常數(shù)[32].整體來(lái)看,蛋白質(zhì)中PHE 等幾種氨基酸含量的增加是Cd(II)脅迫/誘導(dǎo)的直接結(jié)果,也是其吸附性能提高的根本原因.關(guān)于這些氨基酸與重金屬離子之間更深入的作用過(guò)程還需要進(jìn)一步研究.

2.3.3 脅迫/誘導(dǎo)前后P.aeruginosa EPS 的FTIR 分析 由于EPS 中存在羧基、羥基、酚基等官能團(tuán),這些基團(tuán)可以參與陽(yáng)離子交換或與金屬形成配合物的過(guò)程[33].通過(guò)傅里葉紅外光譜分析,可得到不同Cd(II)化合物脅迫/誘導(dǎo)前后P.aeruginosa EPS 中官能團(tuán)的變化,從而進(jìn)一步探究EPS 與重金屬離子的結(jié)合機(jī)理.

Jiang 等[44]發(fā)現(xiàn)峰強(qiáng)度與官能團(tuán)的濃度或數(shù)量有關(guān).根據(jù)圖5、表2,脅迫/誘導(dǎo)后沒(méi)有產(chǎn)生新的峰,表明EPS 在脅迫/誘導(dǎo)后官能團(tuán)的種類沒(méi)有變化.然而,在Cd(NO3)2-EPS 脅迫作用下,峰強(qiáng)度最大,表明EPS 中官能團(tuán)的濃度或數(shù)量有所增加,特別是1394～1406cm-1代表的COO-相關(guān)的C=O 對(duì)稱拉伸和1645cm-1代表的C=O/C-N 的變化較明顯,表明C=O/C-N 的數(shù)量增加.位于3445～3454cm-1處的峰值屬于蛋白質(zhì)中的N-H 和多糖中的O-H.位于1099cm-1處的峰屬于C-OH 和C-O.上述結(jié)果表明,脅迫/誘導(dǎo)后產(chǎn)生的EPS 中存在蛋白質(zhì),且C=O/C-N、N-H、O-H 等官能團(tuán)在重金屬吸附過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.通過(guò)不同外源Cd(II)脅迫/誘導(dǎo),提高EPS 中的蛋白質(zhì)類物質(zhì)如類色氨酸、類酪氨酸的含量,以提供更多的官能團(tuán),如C=O/C-N、N-H、O-H等,這些官能團(tuán)參與重金屬的胞外吸附與轉(zhuǎn)化[45],使得更多的吸附點(diǎn)位暴露,重金屬得以被附著其上,從而提高了EPS 的吸附能力,這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

表2 傅里葉紅外光譜中主要官能團(tuán)的信息Table 2 Information on the main functional groups in the FTIR spectra

圖5 脅迫/誘導(dǎo)下的EPS 的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FTIR of EPS under stress/induction

2.3.4 脅迫/誘導(dǎo)前后P.aeruginosa EPS 的XPS 分析 為了比較分析脅迫/誘導(dǎo)前后EPS 的元素組成和化學(xué)狀態(tài),采用XPS 對(duì)EPS 進(jìn)行分析.樣品中C 1s和O 1s 的能量峰分別在286eV 和532eV 處檢測(cè)到,峰強(qiáng)度較大,表明EPS 主要由C 和O 元素組成.400eV 時(shí)檢測(cè)到N 元素,但含量相對(duì)較少.同時(shí),在1069eV 附近檢測(cè)到一個(gè)較弱的Na 1s 峰,這可能是由于EPS 提取過(guò)程中使用了NaCl 溶液洗滌菌體,并且樣品培養(yǎng)基中也含有少量Na.脅迫過(guò)程中加入的Cd(II)含量非常小,為mg 級(jí)別,后續(xù)的樣品離心洗滌過(guò)程中也會(huì)清洗掉其中的Cd(II),故XPS 很難檢測(cè)到峰.

C 的化學(xué)狀態(tài)主要有3 種類型:C-C/C-H、C-N/C-O 和C=O.結(jié)果表明,脅迫/誘導(dǎo)后,三種EPS的C-C/C-H 含量都降低,而C-N/C-O 和C=O 含量都增加,表明EPS中的C元素發(fā)生C-C/C-H斷裂,C-與O 或N 元素結(jié)合形成C-N 或C=O 而存在于蛋白質(zhì)中,說(shuō)明該菌株在處理后可產(chǎn)生富含蛋白質(zhì)的EPS[50].總體而言,CdCl2-EPS、CdSO4-EPS、Cd(NO3)2-EPS 的C-(H,C)的數(shù)量減少,而C-(O,N)的數(shù)量增加.這種具有碳結(jié)構(gòu)的含氧/氮官能團(tuán)可以提高EPS 對(duì)重金屬的去除能力[51].比較不同脅迫情況,發(fā)現(xiàn)Cd(NO3)2-EPS 的 C-(O,N)含量最高.因此,Cd(NO3)2-EPS 的蛋白質(zhì)含量最高,對(duì)重金屬的吸附效果最好.這與前面開展的研究結(jié)論一致,表明該菌株在Cd(NO3)2脅迫/誘導(dǎo)作用后能產(chǎn)生更多具有高吸附性能的特異EPS.

O 有兩種化學(xué)狀態(tài):C-O-C/C-OH 和C=O.由圖6 和表3 可知,CdCl2-EPS、CdSO4-EPS、Cd(NO3)2-EPS 的C-O-C/C-OH 降低,而C=O 有所增加,說(shuō)明在脅迫/誘導(dǎo)過(guò)程中,部分C-O 轉(zhuǎn)化為C=O,C=O 有利于EPS 增強(qiáng)與金屬的結(jié)合能力[52].而Cd(NO3)2-EPS的C=O 的含量最高,EPS 的金屬平衡吸附量最高,與前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

表3 脅迫/誘導(dǎo)前后P.aeruginosa EPS 的高分辨率XPS C 1s、O 1s 光譜分析Table 3 High-resolution XPS C 1s and O 1s spectra of P.aeruginosa EPS under stress/induction

圖6 脅迫/誘導(dǎo)下EPS 的X 射線光電子能譜C 1s(a)、O 1s(b)光譜分析圖Fig.6 C 1s(a)and O 1s(b)spectral analysis of EPS under stress/induction

2.4 競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)

從圖 7a 可以看出,在單一/雙組分系統(tǒng)中Control-EPS、Cd(NO3)2-EPS 對(duì)Cd(II)的平衡吸附量均隨時(shí)間增加,然后達(dá)到最大值.但是,兩種金屬會(huì)由于競(jìng)爭(zhēng)而產(chǎn)生一定的抑制作用.即EPS 在單組分系統(tǒng)中的平衡吸附量均高于雙組分系統(tǒng).EPS 對(duì)Zn(II)的吸附情況稍有不同,在單組分系統(tǒng)中,吸附過(guò)程與Cd(II)類似;在雙組分系統(tǒng)中,Control-EPS、Cd(NO3)2-EPS 對(duì)Zn(II)的平衡吸附量先呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì),但達(dá)到最大值后會(huì)開始降低.

一種可能的機(jī)制是EPS 對(duì)Cd(II)的親和力高于Zn(II).在初始階段,EPS 有足夠的活性位點(diǎn),金屬離子被吸附.然而,隨著吸附過(guò)程的進(jìn)行,位點(diǎn)可能不足,Zn(II)被釋放,直接導(dǎo)致Zn(II)的吸附量隨后減少.

為了進(jìn)一步研究EPS 對(duì)Cd(II)、Zn(II)的競(jìng)爭(zhēng)吸附性能,采用競(jìng)爭(zhēng)性Langmuir 模型分析其關(guān)系.由表4 可知,該模型的R2為0.9261～0.9964,擬合結(jié)果相對(duì)較高,可以較好地描述競(jìng)爭(zhēng)性吸附過(guò)程.競(jìng)爭(zhēng)性Langmuir 吸附等溫線模型認(rèn)為一個(gè)吸附位點(diǎn)只能容納一種吸附物,不能同時(shí)被兩種或兩種以上的吸附物占據(jù).因此,擬合結(jié)果表明同一活性位點(diǎn)不能同時(shí)容納 Cd(II)和 Zn(II),兩者存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系.同時(shí),Cd(II)對(duì)Zn(II)的抑制作用大于Zn(II)對(duì)Cd(II)的抑制作用,該結(jié)果表明Cd(II)更容易被EPS 吸附.

表4 EPS 對(duì)Cd(II)和Zn(II)的競(jìng)爭(zhēng)Langmuir 吸附等溫線模型參數(shù)Table 4 Competitive Langmuir adsorption isotherm model parameters of EPS for Cd(II)and Zn(II)

金屬離子的吸附特別依賴于重金屬離子的初始濃度[53].如圖7c、7d所示,當(dāng)干擾離子存在時(shí),Control-EPS、Cd(NO3)2-EPS 對(duì)目標(biāo)金屬離子的平衡吸附量均隨初始濃度的增加而逐漸增加,且雙組分系統(tǒng)的平衡吸附量均低于單組分系統(tǒng)時(shí)的平衡吸附量.當(dāng)15mg/L Zn(II)在100mg/L Cd(II)下共存時(shí),2 種EPS 對(duì)Cd(II)的平衡吸附量較單組分系統(tǒng)有所減少,但下降幅度相對(duì)比較小.而當(dāng)15mg/L Cd(II)在100mg/L Zn(II)下共存時(shí),Control-EPS 對(duì)Zn(II)的平衡吸附量從單組分系統(tǒng)的537.20mg/g EPS 降至363.32mg/g EPS,減少了32.37%;Cd(NO3)2-EPS 對(duì)Zn(II)的平衡吸附量從單組分系統(tǒng)的616.17mg/g EPS 降至414.52mg/g EPS,減少了32.73%.在金屬離子濃度較低的情況下,EPS 上的吸附位點(diǎn)充足.隨著金屬離子濃度的增加,更多的金屬離子可用位點(diǎn)被占據(jù),直至飽和,因此對(duì)金屬離子的吸附能力保持不變[54].Cd(II)對(duì)這些活性位點(diǎn)的親和力顯然更強(qiáng),更容易吸附.當(dāng)金屬離子濃度超過(guò)一定水平時(shí),Cd(II)將被EPS 優(yōu)先吸附.因此,當(dāng)Zn(II)是競(jìng)爭(zhēng)離子時(shí),目標(biāo)離子的吸附性能變化不大.然而,當(dāng)Cd(II)是競(jìng)爭(zhēng)離子時(shí),EPS 對(duì)目標(biāo)Zn(II)的吸附能力大大降低.

圖7 單組分和雙組分吸附體系下不同接觸時(shí)間(a、b)和初始目標(biāo)重金屬濃度(c、d)對(duì)P.aeruginosa EPS 吸附Cd(II)和Zn(II)的影響Fig.7 The effects of different contact times(a、b)and initial target heavy metal concentrations(c、d)on the adsorption of Cd(II)and Zn(II)by P.aeruginosa EPS under monocomponent and bicomponent adsorption systems

3 結(jié)論

3.1 在不同的Cd(II)化合物中,Cd(NO3)2是最有效的誘導(dǎo)劑.在最優(yōu)脅迫/誘導(dǎo)條件下,EPS 中的蛋白質(zhì)增幅最顯著,均增加一半以上,尤其是Cd(NO3)2-EPS,達(dá)到409.31%的漲幅值,其對(duì)Cd(II)的平衡吸附量也提高了近50%.

3.2 高效液相色譜顯示EPS 蛋白中氨基酸的變化,這與EPS 的吸附性能有關(guān).通過(guò)對(duì)3D-EEM、FTIR和XPS 的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),EPS 蛋白中的N-H、C-N和C=O 是Cd(II)吸附的關(guān)鍵因子.

3.3 競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)表明,EPS 對(duì)Cd(II)具有較高的親和力.EPS 在Cd(II)/Zn(II)溶液中選擇性分離富集Cd(II)具有廣闊的應(yīng)用前景.